【求助】大家看看我的2-DE图有什么问题，应怎样改进实验！

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• BOSS2011 (2013-12-23 15:17:40)

  没有实验条件，怎么改进？

• bs4665 (2013-12-23 15:18:07)

  小弟也要做这个，但是不懂，
  顺路请教楼主几个问题：
  在第一维电泳时，
  胶条是不是放泡整个buffer中，buffer中可以含有样品？
  那么蛋白是怎么样进入胶的呢？

• xingyi08 (2013-12-23 15:19:15)

  
  先解决后面一个的问题：胶条是整个泡在Buffer中的，buffer中有蛋白样品，蛋白溶解在buffer中，随着buffer被干胶条的吸收而进入胶条，
  关于楼主图普上大大的一块影子，估计是那一部分里面含有杂质，另外，楼主的聚焦感觉还不够充分

• bhka (2013-12-23 15:19:43)

  QUOTE:

  原帖由 BOSS2011 于 2013-12-23 15:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  没有实验条件，怎么改进？

  实验条件
  1、2g蚯蚓在液氮中研磨成粉末
  2、加入8ml -20℃预冷提取液（20%TCA,1%β-巯基乙醇），在-20℃的条件下放1h，然后离心（4℃ 10000rpm 30min）弃上清。
  3、沉淀加入10ml -20℃预冷甲醇和丙酮分别洗4次，每次摇匀后离心（4℃ 10000rpm 10min），然后真空冷冻干燥沉淀成干粉，备用。
  4、取20mg干粉，加1ml样品制备液（7M尿素，2M硫脲，2%CHAPS,65Mm DTT，0.5%IPG Buffer）室温放置1h，期间经常摇匀，然后离心（室温，15000rpm以上30min），上清待用。
  5、用2-D Quant Kit定量蛋白。
  上样量：500ug 450ul 24cm非线性胶条pH 4-7
  等电聚焦程序：S1 Stp 30V 6h; S2 Stp 60V 6h; S3 Stp 100V 1h; S4 Stp 200V 1h; S5 Grd 500V 1h; S6 Grd 1000V 30min; S7 Grd 5000V 2h; S8 Grd 10000V 1h; S9 Stp 10000V 55000Vhr
  IPG 胶条平衡两次，每次15 分钟。第一次加DTT，第二次加IAA
  平衡液(75mM Tris-HCl , pH 8.8，6 M 尿素, 29.3% (w/v) 甘油，2%(w/v) SDS，0.002%溴酚蓝)
  考马斯亮蓝G-250染色：
  1. 固定1h，固定液（100ml乙酸，400ml甲醇，加水至1L）
  2. 染色8h，染色液（0.5g G-250，6ml磷酸，50g硫酸铵，125ml乙醇，加水至500ml）
  3. 用去离子水脱色，直至背景清晰。

• bhka (2013-12-23 15:20:04)

  QUOTE:

  原帖由 xingyi08 于 2013-12-23 15:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  先解决后面一个的问题：胶条是整个泡在Buffer中的，buffer中有蛋白样品，蛋白溶解在buffer中，随着buffer被干胶条的吸收而进入胶条，
  关于楼主图普上大大的一块影子，估计是那一部分里面含有杂质，另外，楼主的聚焦感觉还不够充分 ...

  我的电压升到1000v时，电流只有25uA，应该聚焦好了，是否还要延长聚焦时间

• xingyi08 (2013-12-23 15:20:30)

  
  聚焦完全与否不是看电流的，电流只能判断大致的蛋白里面离子含量的高低，但离子含量与蛋白聚焦只是理论上相关，但实际几乎没有关系，因为除了蛋白离子以外还有很多其它离子，即使蛋白完全聚好了，还是有电流的，主要观察的是电泳后的图谱，根据图谱上聚焦效果的好坏调整聚焦时间，最后确定一个聚焦时间即可，以后不管电流是大还是小，只有聚焦总时间达到了，基本就能聚集完全，看你的图谱，应该需要增加聚焦时间，我这边列一个我自己的标准时间以做参考：24cm,PH=4-7,1mg蛋白，聚焦120000Vhours，你可以根据这个作为参考，适当增加或减少聚焦时间，祝实验顺利！

• bhka (2013-12-23 15:20:53)

  QUOTE:

  原帖由 xingyi08 于 2013-12-23 15:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  聚焦完全与否不是看电流的，电流只能判断大致的蛋白里面离子含量的高低，但离子含量与蛋白聚焦只是理论上相关，但实际几乎没有关系，因为除了蛋白离子以外还有很多其它离子，即使蛋白完全聚好了，还是有电流的，主要观察的是电泳 ...

  谢谢您这么透彻得给我分析结果，能否把你得图谱传上来给我们参考一下？

• dongdongqiang (2013-12-23 15:27:06)

  我的电压升到10000V时电流是32uA，这样大电流算大吗？

• xingyi08 (2013-12-23 15:27:49)

  
  我的图片：水稻，PH=4-7
  

  
  39248083.snap.jpg

• xingyi08 (2013-12-23 15:28:08)

  
  银染的，继续，

  
  78799939.snap.jpg

• xingyi08 (2013-12-23 15:28:47)

  
  不过银染的因为点太多，而且重复性不太好控制，所以我现在已经不做银染的了，直接用考染的分析和鉴定就可以了！

• xingyi08 (2013-12-23 15:29:08)

  
  上面那张考染的图片背景还没有清洗干净，如果清洗干净的话会更好看，

• wawa (2013-12-23 15:29:36)

  我的图片：水稻，PH=4-7，
  
  =======================================
  
  哇，前辈的植物2-D跑得很漂亮呀，羡慕ing~~~

• duoduo (2013-12-23 15:31:07)

  蚯蚓 洗干净了再说
  那一片很像是多糖

• 喵咪 (2013-12-23 15:31:35)

  xingyi08你的图太漂亮了
  简直可以作为标准图
  可以详细介绍一下提取方法，后面的溶解以及聚焦条件吗
  这样更多人可以受益

• 莲花白 (2013-12-23 15:32:02)

  我的图片：水稻，PH=4-7，
  
  ======================================
  
  能问下 你这是水稻哪个部位的样品？是根的吗？

• xingyi08 (2013-12-23 15:32:25)

  大家有上生物谷吗？里面有老生谈电泳系列帖子，从提取到染色都有，可以看到所有的操作，我这里就不再叙述了！期望大家实验顺利！

• bhka (2013-12-23 15:33:15)

  最近又做了实验，蚯蚓洗干净了，还是不理想，希望大家给点建议

  
  73738367.jpg

• bhka (2013-12-23 15:33:36)

  
  最近做的，大家看看哪个效果好点？
  93799

  
  58294139.jpg

• bhka (2013-12-23 15:33:55)

  
  93800

  
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