【求助】免疫沉淀

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• youyou99 (2013-12-23 16:17:14)

  我做的IP是用琼脂糖珠把目标抗原给拉下来的 。一般的原理就是先用抗体把抗原给pull down.然后用琼脂糖珠把抗原抗体混合物给pull down。这时候离心得到沉淀。然后用相应的缓冲液清洗（偶就用PBS）。如果IP下来做激酶分析则严格的多。
  离心的问题很烦人。因为离心的G不够，则丢失严重，G过高，则有可能断裂（猜测）
  我的导师的意见是 如果是用琼脂糖珠 13000转都没问题！一般推荐高速瞬时离心。也就是 控制在5分钟内。现在都流行30秒。我实验室里的是ependoff低温高速离心机。如果离心机比较差，达到最高转速用的时间比较长，就要相应的增加时间。毕竟条件是要摸索的
  

• 89tongzijun (2013-12-23 16:17:35)

  
  我做得大概和你们的有点不一样，我是自己把两个蛋白在体外交联以后，用免疫沉淀法来鉴定这个复合物。文献上都是用这样的方法，我有点不明白的地方就是，如果那个样本是从细胞裂解得来的，那么是通过离心来得到上清液，而我的本身就是蛋白质了，那在加抗体和protein-A之前需要怎么样的处理呢

• youyou99 (2013-12-23 16:17:55)

  
  你的两个蛋白怎么交联啊？GST？
  你那是做的是CO-IP吧 如果A蛋白和B蛋白反应形成混合物，则用抗A把复合物拉下来，跑WB，用抗B验证复合物中有B存在。
  如果是从细胞裂解得到蛋白，肯定要高速离心得到蛋白。我觉得你本身就是蛋白质相互作用了，沉淀甚至肉眼都能看的见吧。我认为就不需要高速离心了，可以1000G左右把沉淀pellet,然后用wash buffer洗上几次。
  至于那个琼脂糖珠，最好预处理下。我不知道你是用什么抗体，你可以查一下，santa cruz就有把抗体和琼脂糖珠提前预混好的。直接照着说明书加就是了。

• 89tongzijun (2013-12-23 16:18:22)

  QUOTE:

  原帖由 youyou99 于 2013-12-23 16:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  你的两个蛋白怎么交联啊？GST？
  你那是做的是CO-IP吧 如果A蛋白和B蛋白反应形成混合物，则用抗A把复合物拉下来，跑WB，用抗B验证复合物中有B存在。
  如果是从细胞裂解得到蛋白，肯定要高速离心得到蛋白。我觉得你本身就是蛋白质 ...

  
  谢谢你，你很热心，我是新手有很多不明白的地方，希望以后还可以得到你的帮助。我看过文献就是把A蛋白与B蛋白在PBS液中混合所得，我还在试验的设计，还没有去实验室，所以不明白的太多了。

• 131415 (2013-12-23 16:18:42)

  请问“IP下来做激酶分析则严格的多”具体是什么意思？不能用PBS清洗吗？我要对IP下来的蛋白进一步测定其ATP酶活性，是不是IP时不能用PBS清洗。
  细胞裂解液有没有什么特殊要求？
  离心1，2000rpm,30秒，可以吗？我总担心在洗涤的过程中将复合物丢失。每次洗涤一定要洗三遍吗？
  我用的是santa cruz的琼脂糖珠，是否需要预沉淀。

• 89tongzijun (2013-12-23 16:19:01)

  楼上的同学你做免疫沉淀做得怎么样了？我现在还在设计阶段还没有近实验室，有很多不懂阿，正如你的如何确定IP时，抗原、抗体以及AGAROSE的最适比例的问题你解决了吗？

• u234 (2013-12-23 16:19:24)

  
  我也是准备阶段。只做过一次预实验，但抗体用量太少，没有沉下多少抗原，WB只看到很浅的条带。
  现在定的抗体还没有到货，因而没有进一步做了。
  最适比例问题，可能得自己摸条件。

• youyou99 (2013-12-23 16:19:45)

  
  我做的IP是把目的激酶给沉淀下来，然后让它和底物反应，这样就把P32标记的ATP给结合上了，然后跑个SDS-PAGE就可以发光了。我不知道你做的什么。但是如果要测定活性肯定是对WASH buffer要求很高的，因为如果在洗的过程中，你不加相应的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂等，你的蛋白就降解掉了。蛋白的分子量不同，离心还是应该有差别的吧,这个条件得自己摸索查资料看看高度类似的文献都是怎么做的。
  santa的珠子我买过，用前要混匀，但是里面放了叠氮钠用来防腐了，应该用你的wash buffer把珠子先清洗下，再平衡一下才能用（原则是该这样）

• u234 (2013-12-23 16:20:09)

  
  我要先IP下来目的蛋白，然后进一步检测目的蛋白的ATP酶活性。
  磷酸酶抑制剂有哪些？
  你说的“再平衡一下”是什么意思？

• ii077345 (2013-12-23 16:20:30)

  我也要做免疫沉淀，琼脂糖珠怎样预处理，怎么样做阴性对照请大家亮一亮，学习学习。

• 3648755 (2013-12-23 16:21:46)

  
  我买的试剂盒中涉及到IP ，请问大家：其中incubate for 1-2 hrs at 4°C with constant rocking，这个rocking 应该剧烈还是温和？在摇床中大约多少转比较好？
  另外下一步是 Wash beads 3 times with 700 mL TBS ，我在做完 IP 4℃ 2小时后 在EP管底部发现有凝胶样东西 这是否就是 beads？这个beads因为是凝胶状的，在洗的过程中非常容易被冲散，只有离心才能再次在EP管底形成，这样会不会对结果有影响啊？