【讨 论】WB时抗体在识别原核过表达和真核过表达载体时...

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• ero11 (2013-12-25 15:28:15)

  
  真核表达的蛋白好还是原核表达的蛋白好，不能一概而论
  有些用途上需要用到原核表达，有些地方要遇到真核表达
  真核蛋白有糖基化和磷酸化的修饰，还有一定的空间结构（有空间结构不一定代表就和原始天然结构一模一样），免疫时，相对容易产生针对蛋白空间表位（活性表位）的抗体。
  原核表达没有以上真核表达的蛋白的优点（对于蛋白空间折叠结构而言，原核表达也可以有可溶表达，但是和天然蛋白的相似度，总体上会比真核表达的差一点），但是在表达的效率，成本，周期上，原核有一定的优势。
  免疫是个很复杂的过程，一个蛋白质打进去以后，到底会产生什么样的免疫效果，很难事先准确判断，个人认为就算是变性蛋白，免疫到动物体内后，也不一定就得不到空间表位的抗体。
  很多成功的IHC应用抗体也是有用变性包涵体免疫的。

• ero11 (2013-12-25 15:30:17)

  
  另外再举一个在工作中遇到的关于原核和真核蛋白免疫的实例
  有1个蛋白B，是血液中的一个检测指标，这个蛋白B是糖蛋白，但是血液中，这个蛋白不同分子的糖基化水平是不均一的。而且不同的人的糖基化水平也是不一样的。
  有个国外公司先是用真核表达这个蛋白B，去免疫，然后筛到一个识别糖基化位点的抗体。但是发现这个抗体无法全面的识别这个蛋白（糖基化的原因）,发现总有些蛋白B没有被该抗体检测到。
  于是后来这个公司又用原核表达的蛋白B，去免疫，筛选了一个识别非糖基化位点的抗体，它能识别不同糖基化水平的蛋白B，由此，解决了一个不能全面检测这个蛋白B的难题。

• ero11 (2013-12-25 15:31:01)

  以前用原核过表达后的蛋白来免疫兔子以此来制备多抗，再免疫数次后，为了检测多抗的效价，一般是跑SDS-PAGE 做一次Western Blot 用血清分别检测 原核过表达的蛋白 真核过表达的蛋白 还可以检测内源性蛋白
  原核过表达的蛋白 和 真核过表达的蛋白 在aa的一级结构上是完全一致的，虽然在二级结构 三级结构 上不一样，但是在经 SDS-PAGE后 应该是线性化了 也就是一级结构完全一致，不存在二级结构和三级结构，也就是抗体识别的蛋白是完全一致的，那为什么在WB的时候会出现抗体能识别原核过表达蛋白而无法识别真核过表达蛋白的情况？？？
  除了蛋白量上的差别外 是否是由于真核和原核对蛋白的修饰情况不同造成的？？
  那是否可以在纯化得到原核过表达蛋白后，对蛋白进行适当修饰后用于免疫，会得到更好的抗体？？
  希望大家能多多说说自己对此的看法。。。
  
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  后天对蛋白的糖基化修饰和磷酸化修饰是不实用的，也是不怎么划算的

• ritou1985 (2013-12-25 15:32:11)

  
  我同事遇到一个问题，她做的一个单抗，能识别原核过表达的蛋白，而不能识别真核过表达的蛋白，我想在WB的时候，不是蛋白都不存在二级三级结构了，原核和真核过表达的蛋白理论上是完全一样的，除了可能的修饰不同。但为什么一个能识别 一个不能识别呢？？

• 101010 (2013-12-25 15:33:06)

  我同事遇到一个问题，她做的一个单抗，能识别原核过表达的蛋白，而不能识别真核过表达的蛋白，我想在WB的时候，不是蛋白都不存在二级三级结构了，原核和真核过表达的蛋白理论上是完全一样的，除了可能的修饰不同。但为什么一个能识别 一个不能识别呢？？
  
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  你同事这个单抗可能是，识别原核蛋白的那个位置，在真核蛋白上刚好是糖基化位点

• ritou1985 (2013-12-25 15:34:15)

  恩 我也觉得很可能识别位点正好在不同的修饰位点上！！ 谢谢你的解答