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【求助】wb突然所有抗体都做不出条带了
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请问,我做的蛋白分别是25kd、38kd和43kd的，之前做的除了操作上不够严谨，显影后条带不是很均匀外，其他问题不大，条带颜色较浓，背景没有明显的颜色和杂带
但从某一天开始，试剂、抗体、试验条件均未更改，就什么都做不出来
重新配抗体、重新购买抗体均不能做出来，连内参也没有一点条带
试验设备和试剂应该没有什么大问题，使用同一套设备和试剂的同学能做出来
这样大概已经有2个星期了，很急，请教能不能帮我分析一下原因
我的实验条件是：
从组织提的蛋白，上样，70v，100v电泳
0.2PVDF膜Bio-rad半干转1mA/cm2 60-65分钟
5%脱脂奶粉室温封闭1小时
santa一抗 1：400，TBST稀释（推荐1：100-1：1000）4°C孵过夜或室温摇3小时，TBST洗膜3*10min
碧云天二抗1：1000TBST稀释（推荐1：1000）室温80分钟,TBST洗膜3*10min
发光剂是碧云天ECL，从来没有看到过任何荧光，之前做的压片5分钟条带明显，现在第一次压片就压20分钟，什么都没有
恳请帮忙~~~多谢
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最新回复
windy+++ (2013-12-25 15:53:20)
不应该这样，你换一个ECL试试！
niangao1980 (2013-12-25 15:53:45)
ECL也换过，用的人家的试的，还是没有
yonger (2013-12-25 15:54:10)
我上一次碰到怎么做都白板的原因是回收的一抗稀释液长菌……
楼主有没注意过体系中的PH值有没有问题
niangao1980 (2013-12-25 15:55:12)
QUOTE:
一抗稀释液我一般都是TBS和脱脂奶粉现配而且TBS也重新配了
还是没有
另外体系中PH值确实没有注意过，只是在配液体的时候会按要求调一下，平常就没怎么管过了
请问这个方面应该怎么注意？？？
yonger (2013-12-25 15:56:23)
另，每次一抗都用新的吗？好有钱……
一抗稀释液里面加过防腐剂吗，如果没有的话，5%脱脂奶配的稀释液4度下放一夜就能长菌，此时细菌会吸附大量的抗体，并使体系的pH值快速下降，很容易就白板……
而且我试过一旦一张膜出现白板的情况，那么这张膜不管再怎么折腾就是做不出来了
niangao1980 (2013-12-25 15:57:04)
QUOTE:
当然不是每次一抗都用新的但因为做不出，所以经常重新配一抗，第一次用的抗体仍然还是白板
另外，请问防腐剂放什么？怎么配比？
lxh031 (2013-12-25 15:58:16)
从你目前的情况来看应该不是某个一抗的问题，而是出在通用的配胶、转膜、ECL、或者是二抗甚至是显影液等的问题上。
推荐你做丽春红染色以推断出在哪个方面：
转完膜之后用丽春红染色看有没有条带。如果没有的话就从蛋白样品、配胶、转膜方面找。如果有的话就从二抗、ECL、显影液上找
有结果了之后再分析是哪个阶段出了问题，比这样定点找问题要来的方便的多。
yonger (2013-12-25 15:59:31)
但因为做不出，所以经常重新配一抗，第一次用的抗体仍然还是白板
另外，请问防腐剂放什么？怎么配比？
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常用的是叠氮钠，这个东西很毒的，而且只能用在一抗稀释液，因为它会影响HRP的活性
楼上说的也有道理，但我总觉得可能出来一抗稀释液变质这个问题上，因为跟我上次出的问题太像了
建议楼主
1、转膜完成后用丽春红染膜，如果条带正常的话，可以基本排除从样品处理到电泳，转膜的问题
2、膜上滴一点点二抗，在暗室里直接加ECL底物后显影，以此排除HRP活性、底物、显影的问题
3、封闭一般不会造成白板的情况
4、如果以上都正常的话，那么问题就在一抗、二抗的结合问题上了，包括本身的效价问题，保存问题，还有就是稀释液的问题了
niangao1980 (2013-12-25 16:01:04)
55
转完膜后考马斯亮蓝染胶有条带
丽春红染膜可以看见泳道和少量条带
二抗和ECL用的别人肯定能做出来的
还是什么都没有
我实在是没有办法了
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