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【求助】Western-blot的条带高高低低，怎么回事？
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这几个条带本来应该是在同一marker水平的，为什么我作出来会是这样有高有低的呢？
我用5%浓缩胶，12%分离胶，（不好意思之前写反了）分子量55KDa，电压为50v和110v
蛋白上样量每孔都相同的。
是因为胶没有混匀吗？或者电泳时电压不稳定？！还有其他的可能引起这种现象吗？！
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18241713.jpg
最新回复
junhun (2013-12-28 11:08:31)
QUOTE:
有以下可能请楼主参考：1、上样体的问题，比如说一个是2ul，有的是20ul，这种差距特别大的时候就有可能出现这种情况。楼主说的"蛋白上样量每孔都相同的"不知是不是排除了这种可能。
2、积层胶的问题，"我用5%分离胶，12%浓缩胶，分子量55KDa，电压为50v和110v"我想楼主应该顺序颠倒了吧。应该是浓缩胶5%，分离胶12%吧。楼主所制胶，积层胶是否一边搞一边低？
这样也可能出现这种情况。
3、分离胶的原因，如楼主自己分析可能是没有混匀。
楼主不会每次都是这样的吧，再做几次看看，如果每次都这样那就是试剂的问题了。、
good luck
gogo (2013-12-28 11:08:54)
个人认为一般不会因为胶的问题造成这么大的影响（因为条带的变化没有规律性，既不是逐渐加深，也不是逐渐变浅），很有可能是在最开始的蛋白提取和蛋白定量的时候就出了问题。一般蛋白提取液在没有混匀的情况下就拿去定量，很有可能出现上述的结果。所以建议在蛋白提取的过程中找原因。
vivian4123 (2013-12-28 11:11:14)
1、上样体的问题，比如说一个是2ul，有的是20ul，这种差距特别大的时候就有可能出现这种情况。楼主说的"蛋白上样量每孔都相同的"不知是不是排除了这种可能。
2、积层胶的问题，"我用5%分离胶，12%浓缩胶，分子量55KDa，电压为50v和110v"我想楼主应该顺序颠倒了吧。应该是浓缩胶5%，分离胶12%吧。楼主所制胶，积层胶是否一边搞一边低？
这样也可能出现这种情况。
3、分离胶的原因，如楼主自己分析可能是没有混匀。
楼主不会每次都是这样的吧，再做几次看看，如果每次都这样那就是试剂的问题了。、
good luck
我上的蛋白量是一样的，比如都上了40ug，但是由于蛋白浓度不一样，所以体积不一样。请问怎么样能保证蛋白量也一样体积也一样呢？！
vivian4123 (2013-12-28 11:11:36)
QUOTE:
"蛋白上样量相同”意思是比如都上了40ug蛋白，但是由于蛋白浓度不同，所以体积不同。请问怎样保证每孔蛋白量和体积都相同呢？vivian4123 (2013-12-28 11:11:58)
QUOTE:
下次我用同一管裂解液来做试试。谢谢！排除一切问题，目的是解决问题
junhun (2013-12-28 11:20:23)
QUOTE:
这个简单，用裂解液调平后再加相应loading buffer,比如一个样是8ul，一个样是2ul，那就把第二个样用裂解液补齐到8ul，然后各加2ulLoading，在上样。根据楼主说体积不同，只是上样质量数一致，很可能问题就出在这里了。
试试吧
至于楼上所说“很有可能是在最开始的蛋白提取和蛋白定量的时候就出了问题。一般蛋白提取液在没有混匀的情况下就拿去定量，很有可能出现上述的结果。所以建议在蛋白提取的过程中找原因。”
最终也是导致浓度不准进而体积调不平，可能出现最终的结果。
u234 (2013-12-28 11:21:15)
浓缩胶太短，电压太大，导致没有压直就到分离胶了
vivian4123 (2013-12-28 11:21:51)
QUOTE:
我是用50v的，电压还大吗？！我是看着压到一条直线才改电压的vivian4123 (2013-12-28 11:22:10)
QUOTE:
我不是很明白：如果每孔上样蛋白的浓度不同的话，那么虽然我保证了ul数相同的，但是蛋白的ug数不就不同了吗？！上样量不同了结果还有可比性吗？！yonger (2013-12-28 11:22:54)
QUOTE:
。。。。。那我试着来回答下，看来上面仁兄的文字表达你没有搞懂那直接上数据应该清楚了吧。比如：
样品a 浓度 10ug/ul
样品b 浓度 20ug/ul
上样量为40ug
那么你需要取
样品a 4ul
样品b 2ul
那么我们可以把体积一起补到8ul(你可以随意取一个大于4的数字，只要跟loading buff的比例好算点），那么我们需要加的裂解液或者NS是：
样品a中加裂解液4ul
样品b中加裂解液6ul
那么样品a离心管中的体积现在是？4+4=8 ，对不？
同理样品b离心管中的体积也是8
如果是5x的loading buff那么两个离心管分别加入2ulloading
总共为4+4+2=10
2+6+2=10
一样了吧，而且其中的蛋白质量也是一样了的吧，这样总懂了吧
如果还是没搞懂。。。。。。。那。。。你数据拿来我们帮你算
vivian4123 (2013-12-28 11:23:27)
QUOTE:
明白了，其实就是把蛋白样品稀释到相同的浓度，再加loading！非常感谢这么详细的解答hot_hot_hot (2013-12-28 11:23:49)
上样体积一定要一样吗？相差个5-10UL不影响吧？
莲花白 (2013-12-28 11:24:12)
我认为相差越少越好的，毕竟体积还是挺好控制的
remonte (2013-12-28 11:24:51)
QUOTE:
以前倒是没怎么注意这个问题，下次我也调整一下。bs4665 (2013-12-28 11:25:32)
QUOTE:
你跟据以上的建议跑胶了吗（我说的是稀释为等体积等浓度的那种）结果怎样？我也面临这样问题，跑出的actin条带量不一致，烦恼啊。期待恢复，谢谢。【求助】Western-blot的条带高高低低，怎么回事？