【求助】3个月了，western毫无进展

最新回复

• flower-201 (2013-12-28 15:08:09)

  
  唉，我也一个月了，除了内参出来过，目的到现在还没出来，郁闷啊

• jrwyyplt (2013-12-28 15:08:35)

  
  你用的是哪个厂家的二抗？
  你一抗就用1：500，把二抗的浓度降低到1：2000或1：5000做一下吧！

• 831226 (2013-12-28 15:08:55)

  
  如果内参有条带,说明体系没有问题.
  目标蛋白没有结果,问题出在你的一抗可能性较大.一抗的质量差别是很大的.新买的的抗体都要做条件的优化.
  建议只用一个样本,重复上样整个胶版,转膜后可以保存在TBS于4度冰箱,也可以加些防腐剂,分几次使用.一个样本切成一个长条,作为优化抗体条件用.
  一抗稀释度 1 2 3 1 2 3
  二抗稀释度 4 4 4 5 5 5
  按照上面的组合,6条膜,每条的抗体浓度组合为1/4,2/4, 3/4,1/5,2/5,3/5
  背景太黑时,除了考虑一抗质量,也可以多洗几次
  条带分不开,可能是你的胶的浓度选择有问题,每个浓度的胶对不同大小的蛋白的分辨力不同,如果你的目标条带很小,考虑选择低浓度的.

• ha111 (2013-12-28 15:09:40)

  
  哈哈。同仁啊，我也是8月学的啦。。现在做的感觉还好，有什么咱也可以讨论下，你最好做个actin,看看你的操作中有没有失误。。再找试剂的问题吧。。

• u234 (2013-12-28 15:10:21)

  
  同病相连，我接近做了一个月了，只作出内参，效果还不错；目的条带也有，不过效果太差，没法用

• yysr238 (2013-12-28 15:10:46)

  
  稀释度1 2 3 代表的是1000倍稀释吗？
  还是比如选中用一个基数之后，按照该比例稀释
  比如 1抗1/500 1/1000 1/1500
  2抗则是1/2000 和1/2500 吗？

• 66+77 (2013-12-28 15:11:15)

  
  WESTERN BLOT失败的最最最重要的一个原因是：抗体质量。请确认是否来自原产CST公司（跟其他产品一样，有名了，所以假货也多）， 以及该公司抗体是否有文献报道使用过。当然，还有2抗。
  第二就是印迹膜的质量。最后才是技术问题。
  western blot是一项非常成熟的技术，别轻易怀疑自己。
  希望以上能对你有帮助。

• avi317 (2013-12-28 15:12:08)

  
  1.曝光。你说的条带连成一串是指各加样孔之间的条带连在一起吗？这是否与你的电泳有关系，还有就是是否曝光过度，一般来说曝光结果可以通过曝光时间进行调整，如果加了发光底物后，肉眼就能看见荧光，那么曝光时间应该短一点，对于非常强的荧光，曝光几秒钟就足够了，如果荧光弱到看不见，曝光几分钟甚至半个多小时也是可以的，你可以多曝光几张片子试试。有的人不放心，总担心曝光不够，所以容易导致曝光过度，背景高，条带也容易连在一起。另外背景脏与抗体稀释倍数有关，也可能与你的操作有关，封闭是否完全（这个一般应该没问题吧）？转膜时胶颗粒是否粘到了膜上（片子上能看到黑点）？洗膜时是否洗干净（增加洗膜时间和次数）？
  2 关于抗体。根据你说的情况，可能是抗体质量不稳定，还有就是所用试剂，器皿要灭菌，否则蛋白酶或细菌污染严重抗体可能会降解，建议最好抗体现用现配，过夜的抗体就不要用了，用过的东西里面有太多不确定因素。还有背景高是否是由于曝光时间太长啊？如果确实背景高，应该是抗体太浓的问题，可加大抗体稀释倍数，1：700/1000,都可以试试，抗体最好都是现用现配。还有必要的话二抗的稀释倍数也要调整，二抗过多，背景也可能高。可以做几个浓度，试一下。
  还有显影液定影液用过一段时间要重配，否则影响片子的效果。希望以上内容对你有用。
  
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  从七月份开始学习做western ， 中间曲折就不说了
  现在我要做的是caspase-3 和elk 样品是老年大鼠的组织蛋白，据说这两个表达一般比较多，应该很容易做出来，
  用的抗体是cst的，都是多克隆抗体，兔抗鼠的
  转膜完毕之后，膜染色能发现清晰的条带，且分离效果较好，
  现在问题主要是两个：
  1个是底片曝光出来的结果不理想，条带连成一串，有的条带背景比较脏。而且经常是1：500的能曝出条带，但背景奇高，取一半稀释一倍再用，反而一个条带也没有了（背景也都消失）
  再就是曝光结果没有重现性，第一天配的抗体，孵育完了显影曝光能出来结果，放4℃过一天，第二天再孵育第二张膜，就曝光不出东西来~
  二抗一般是1000稀释，用二抗和ecl的发光系统混合，暗室里面观察的效果感觉不错，荧光很强烈...这样的话也会坏掉吗？
  显影定影系统没有问题，曝光标签次次都出。
  我老怀疑是抗体不好，但是能做出结果来说明东西都没坏，各位同仁提示下操作上我应该注意哪些方面？还有需要更换哪些试剂？一个朋友提示说可能1：500的出但背景过高可能会大量的把抗体结合掉了，再稀释1倍做可能一抗含量非常低，结果就出不来了。这个分析有道理吗？
  单纯一个实验做不好可以多总结多讨论，可是涉关自己的前途，压力就比较大了，眼看阳历年大限将至，心里那个滋味啊...

• wmp1234 (2013-12-28 15:12:37)

  
  哎，原来做wb做的郁闷的不止我一个呐，因为是新买的GE的系统，操作和以前用的bio-rad的有所不同，摸索了很久。结果也是时好时坏的。一会漏胶问题，一会转膜转不上去，有时内参缺失。失败的原因真是太多了。很多你是无法理解的。只能一个个去排查。

• am10 (2013-12-28 15:13:21)

  
  1,2,3,4,5 指不同的稀释度,可以参照公司给出的使用浓度设计.你后面的理解是对的.但可以把梯度拉大一些.
  
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  稀释度1 2 3 代表的是1000倍稀释吗？
  还是比如选中用一个基数之后，按照该比例稀释
  比如 1抗1/500 1/1000 1/1500
  2抗则是1/2000 和1/2500 吗？

• redbutterfly (2013-12-28 15:16:14)

  
  内参能做出来吗？背景脏不脏？
  目标条带连成一串，可以隔孔上样。
  抗体被洗掉了？你直接一抗1比1000不就行了吗?
  
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  从七月份开始学习做western ， 中间曲折就不说了
  现在我要做的是caspase-3 和elk 样品是老年大鼠的组织蛋白，据说这两个表达一般比较多，应该很容易做出来，
  用的抗体是cst的，都是多克隆抗体，兔抗鼠的
  转膜完毕之后，膜染色能发现清晰的条带，且分离效果较好，
  现在问题主要是两个：
  1个是底片曝光出来的结果不理想，条带连成一串，有的条带背景比较脏。而且经常是1：500的能曝出条带，但背景奇高，取一半稀释一倍再用，反而一个条带也没有了（背景也都消失）
  再就是曝光结果没有重现性，第一天配的抗体，孵育完了显影曝光能出来结果，放4℃过一天，第二天再孵育第二张膜，就曝光不出东西来~
  二抗一般是1000稀释，用二抗和ecl的发光系统混合，暗室里面观察的效果感觉不错，荧光很强烈...这样的话也会坏掉吗？
  显影定影系统没有问题，曝光标签次次都出。
  我老怀疑是抗体不好，但是能做出结果来说明东西都没坏，各位同仁提示下操作上我应该注意哪些方面？还有需要更换哪些试剂？一个朋友提示说可能1：500的出但背景过高可能会大量的把抗体结合掉了，再稀释1倍做可能一抗含量非常低，结果就出不来了。这个分析有道理吗？
  单纯一个实验做不好可以多总结多讨论，可是涉关自己的前途，压力就比较大了，眼看阳历年大限将至，心里那个滋味啊...

• yysr238 (2013-12-28 15:16:42)

  
  感谢诸位同仁的热心帮助。我使用的2抗是国产的，最近几次实验解决了一些问题，但是还是问题还是没有完全解决
  最近的几次，第一次是跟老师一起做的，她负责配胶和转膜，我负责后期抗体孵育和显影，手头的几个一抗，配好了之后孵育显影，将洗脱时间和次数稍微延长了一下，另外孵抗体条件改成4℃条件下，结果还不错，除了一个抗体因为检测蛋白量特别大而且是多克隆抗体造成的非特异性条带比较多之外，其他的都条带清晰背景很低且无杂带出现。基本上背景高的问题应该不再有了，
  第二次就是紧接着第一次结束之后做，操作基本上完全由我来做，转膜之后，我担心我的技术不行，特意染了下膜，发现条带分的比较开，而且染色液比较清晰，封闭液，一抗和二抗都是用的2天前配的，只用过一次，条件也都没变，但重复结果就很差，有的是完全显不出条带来，有的就是条带显得很浅，高含量的还清楚，低含量的就直接浅的拍都拍不出来。总之，重复性还是不好，相当于western技术还是不行..
  9楼的chun同学建议我灭菌，这个我以前从来没注意过，如果要注意无菌条件的话，那难道还要无菌工作室？还是只要自己多注意，尽量避免细菌污染就可以呢？8楼的lee同学让我注意下抗体来源，这个都是老师自己联系，据描述一般都是生物公司从cst联系进货，来源我也不敢说，但因实验要求抗体较多，老师一般联系的都是报价便宜的，现在是7.3折的一个小公司。
  内参的一抗二抗都是使用的国产的，效果非常好，没有杂带背景很低。
  学梯度稀释的建议我跟老师反映了，但老师现在基本上不怪别的只怪***作问题，她认为抗体按现在稀释就好，只是让我想办法改进操作.....

• yysr238 (2013-12-28 15:17:03)

  
  假如按chun同学所说，过夜的抗体就不用的话，那我的重复实验可以改为：一抗二抗均现用现配 假如这样能够重复出来的话，证明的确是抗体污染或者是效价丧失..这样的话正式试验就按照现用抗体现配就可以 ，对吗？以前我也曾经提过类似的想法，老师却觉得连续的两天内做，抗体不会坏...不行我就做个对比实验让老师看看
  5楼建议我用actin，我选用的是GAPDH，效果也很理想，内参应该不是主要影响因素。

• yysr238 (2013-12-28 15:21:11)

  另外我请教大家一个问题：我的一抗现在时用脱脂牛奶5%的TBS/T配制的，一周以后牛奶如果变质了之后，会不会影响抗体的使用呢？将一抗改用TBS/T配制（不用BSA或脱脂牛奶）对抗体的结合会不会产生特别不好的影响？

• eric930 (2013-12-28 15:21:41)

  
  一抗.我以前一直用国了保存4度,过了几天就不能用了.现在,用过一次后加牛奶至5%,冻在-20.可以重复用很多次.牛奶可以防止抗体被管壁吸附.