【转帖】western 瓶颈

最新回复

• 大海啊故乡 (2013-12-28 15:23:22)

  QUOTE:

  原帖由 ukonptp 于 2013-12-28 15:22 发表
  本人做western许多次，都没有出结果：
  1.蛋白浓度尚可（50ug上样）
  2.电泳过程可，（已将他人蛋白内参做出结果）
  3.转膜可（丽春红染色可见明显条带）
  4.一抗，二抗无问题，用与他人可出结果
  请高手指点，为什么不出结果，在线等答案！ ...

  
  那就是你蛋白提取有问题了
  

• jujuba (2013-12-28 15:24:18)

  
  确定你样本中有你需要的蛋白吗？

• ukonptp (2013-12-28 15:24:36)

  
  内参没有做出来。

• ukonptp (2013-12-28 15:25:01)

  那就是你蛋白提取有问题了
  我用的是现配的裂解液，配方是
  dtt 0.0154g
  sds 0.3g
  tris6.8 0.5ml
  甘aa 0.5g
  naf 0.0021g
  pmsf 0.1%
  有人说可能是pmsf-20度存放过久失效 ？所以打算新配再试一下

• nn255 (2013-12-28 15:25:29)

  我以前有段时间也一直做，后来发现蛋白那个阶段不表达，当然没有了，所以还是从蛋白方面多下功夫吧

• BUK (2013-12-28 15:26:57)

  
  版主：
  组织在-70度放置半年后还能提蛋白做Western吗？

• remenb (2013-12-28 15:27:32)

  
  既然-70度保存病毒的毒种可以保存3年，那组织当然也可以

• yychen (2013-12-28 15:27:57)

  
  我遇到过类似的问题-连续五次内参都未发出来!!原因：巯基乙醇加多了，你是不是按总体积的5%加的？应该是加上样BUFFER的5%!!!
  重新收一批蛋白，按后者的量加就没问题了。

• yychen (2013-12-28 15:28:49)

  是不是本身蛋白表达丰度就不是很高，另外可以加大一抗的用量看看

• xyw5 (2013-12-28 15:29:10)

  
  我想请问下立春红染料的配置 我配置的基本上看不出条带 谢谢

• windy+++ (2013-12-28 15:30:05)

  
  请问一下，你做的是组织蛋白，那么蛋白提取液用单去污比较好，而如果做的是细胞蛋白的话，就用三去污，裂解效果强一些。我以前用三去污的做组织的蛋白，谁知道，杂带很多，一片黑印，后来换用了单去污较果好多了。

• NBA (2013-12-28 15:31:53)

  
  1.你的蛋白分子量多少？我们来帮你确定转膜时间。丽春红所见到的是蛋白总体的转膜情况，并不是你的靶蛋白情况。如果分子量大的，时间要长一些，分子量小的时间短些。
  2.你的靶蛋白丰度如何？做不出，就加大总蛋白量。我最大上到过总蛋白量200微克，甚至更高。对付低丰度的蛋白，我还是有些经验的。
  3.换一抗。一抗的好坏，是WB的灵魂所在，如果实在出不来，索性咬牙买好的抗体。别用santa的，也别用分装的。狠心买一支cell signaling的。备注，精品一抗是可以反复使用的（－20度保存）
  4.改变提取方法，如果是膜蛋白，超声。如果是定位于靶器官的蛋白，如核蛋白，线粒体蛋白等，建议你做细胞器的提取。之后再用粗提物做WB.
  5.有问题尽管问吧，我已经做了上千WB了。各种怪蛋白都遇过了。当年也得到丁香园友的帮助，现在翅膀小硬，也希望帮助后来的战友。

• mybioon (2013-12-28 15:32:13)

  
  膜上有蛋白，但是内参没做出来
  可能原因：1 蛋白未变性？
  2 内参的一抗或者二抗有问题。
  建议还是先把内参做出来。

• is2011 (2013-12-28 15:32:33)

  
  显色剂正常吗