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红外光谱及其图像技术在生物医学中的应用
宋占军 沈世杰 赵晓光红外光谱及其图像技术在生物医学中的应用
(国家生物医学分析中心 北京 100850)
摘 要 ：本文介绍了傅里叶变换红外光谱分析技术在蛋白质、核酸、细菌和药物等领域的应用及红外图像技术在生物细胞、组织的成分及化学结构分析等中的应用。
关键词 傅里叶变换红外光谱 红外图像 蛋白质 核酸 细菌
光谱傅里叶变换红外光谱仪(Fourier Transform Infrared spectrometer)[1] 简称FTIR，它具有高光通量、低噪声、测量速度快和高分辨等优点。傅里叶变换红外光谱仪 ，一般由计算机系统和光学系统组成。其仪器的核心部分是光学系统中的迈克尔逊干涉仪。把迈克尔逊干涉仪所产生的干涉光信号变成干涉图，再对干涉图进行傅里叶变换获得红外光谱图。
1 傅里叶变换红外光谱的数据处理
1.1 红外光谱数据处理技术
1.1.1 差谱技术(又称谱图差减技术或光谱剥离技术等)。
在实验研究过程中，往往需要扣除溶剂、基体、分离混合物以及空气中水蒸汽、二氧化碳等“背景”吸收。根据比尔-郎伯定律，在吸收强度对应关系的基础上进行差减。FTIR提供了数字化的红外光谱图，适合进行各种数学计算。差谱技术在生物医学研究中有广泛的应用。
1.1.2 傅里叶去卷积技术(Fourier Self-Deconvolution)。对凝聚相样品而言，由于分子间的相互作用，红外光谱的实测谱带都具有接近洛仑兹函数的线形，谱带的固有宽度通常大约为2cm-1或稍大些。实验能够获得的光谱分辨率取决于这个洛仑兹线形的分辨率。从数学角度来讲，红外光谱谱带的轮廓是一个比较尖锐的谱线和一个洛仑兹函数卷积的结果。所以为了增强光谱表观分辨率，去掉这一线形的过程称为去卷积。
1.1.3 导数光谱技术( Derivative Spectra)。FTIR光谱仪的导数光谱是利用计算机对光谱进行微商处理而得到的光谱，导数光谱在红外光谱中的应用主要是二阶导数谱。偶数阶导数可以容易分辨强峰上的小肩峰，在二阶导数谱中吸收峰方向与原谱相反，在四阶导数谱中吸收峰方向与原谱相同。
1.1.4 谱带拟合技术(Curve Fit)。从数学角度来看，谱带拟合技术就是将一组重迭在一起的一个峰形较宽的吸收谱带通过适当的方法分解为一组单峰(子峰)。单峰(子峰)的数目、峰的位置及积分面积可以通过拟合得[2]。
2 傅里叶变换红外光谱在生物医学中的应用
t7lt-B(K{蛋白质和多肽的结构测定一般依赖于X-射线晶体学技术、核磁共振、圆二色、红外光谱和拉曼光谱方法, FTIR可以有效测定蛋白质溶液的二级结构，酶催化反应机理研究，蛋白质溶剂变性、热变性、化学修饰研究，膜蛋白性质研究，药物与蛋白质相互作用，细菌的分类及鉴别等研究。
2.1 蛋白质的二级结构研究
蛋白质是由氨基酸以酰胺键共价连接而成的多肽链构成的，同一多肽链或不同多肽链之间还以二硫键形成侧链共价交联。蛋白质的二级结构是指蛋白质中多肽的规则排布，由主链极性基团的氢键形成，常见的二级结构有α—螺旋、β—折叠、β—转角、无规卷曲等。这些结构或其它构象都有其特定的氢键结构，而这些氢键结构的差异可以通过红外光谱得到反映。
一般蛋白质和多肽的傅里叶变换红外酰胺Ⅰ谱带去卷积谱包含9～11个子峰，各子峰的精确峰位由二阶导数谱确定，各子峰的结构归属通过已知结构的蛋白质的研究予以确定[3,4]。
2.1.1 药物与蛋白质相互作用
应用傅里叶变换红外光谱可以了解蛋白质与不同性质的药物作用前后结构变化的信息。采用傅里叶变换红外光谱技术观察分析镍、镉两金属与红细胞膜作用前后细胞膜红外吸收的变化情况[5]。
2.1.2 酶催化反应机理研究
傅里叶变换红外光谱学方法在测定酶的作用机制和反应的动力学过程方面有一定的优势。Fisherd[6]等应用傅里叶变换红外光谱法研究了b-内酰胺抗生素被b-内酰胺酶水解的过程。
2.1.3 蛋白质溶剂变性、热变性、化学修饰等研究
应用傅里叶变换红外光谱可以了解蛋白质构象变化的信息。溶剂环境、热变性和化学变性等手段更加全面地了解蛋白质的结构知识[7]。
2.1.4 膜蛋白性质研究
当FTIR应用于生物膜研究时，观察到的吸收峰是脂、蛋白和生色团的吸收贡献。目前FTIR已经广泛应用于细菌视紫红质、嗜菌体壳蛋白、信号肽、信道形成肽、脱血红素细胞色素C等的结构测定以及膜蛋白与磷脂膜的相互作用等研究领域[8]。
2.2 核酸的红外光谱
FTIR 技术能够区分DNA和RNA中的A-U和G-C碱基对，并能反映出磷酸根、C-O单键、金属配合物的配位键等结构特征，已经广泛应用于DNA和RNA与金属加合物的相互作用、静态和动态条件下DNA的水化过程等应用领域。有人曾应用FTIR光谱研究了肿瘤抑制药物顺式二氨基二氯化铂的抗癌机理[9]。
2.3 细菌的分类及鉴别
细菌的常规分类及鉴别是应用显微镜(形态学方法)法、生化法和生理学方法相结合的技术。虽然有效，但手续复杂，费时费力，有时较难得到准确可靠的结果，自动化和计算机化也难达到理想的结果。应用傅里叶变换红外光谱方法结合多变量统计分析的手段，可以实现对致病菌进行分类和鉴别。能在菌种(species)甚至菌株(strain)水平上提供可靠的检定结果[10,11,12]。
3 红外显微镜技术在生物医学中的应用
傅里叶变换红外光谱仪,可以配备具有扩展测试功能的附件如红外显微镜，用于测定微量和生物样品的红外光谱。通过显微镜观察被测样品的外观形态或物理微观结构，可直接测试样品某特定部位的化学成分，得到该微区物质的高质量红外谱图。
3.1红外显微镜的结构及性能特点：
红外显微镜是由显微镜观测系统、光学系统和检测器所组成。当来自傅里叶变换红外光谱仪主机光学台的干涉红外光进入红外显微镜系统之后，经光学聚焦到显微镜的载物台中心并形成测试样品的光路。
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ross_racheal (2010-7-27 14:39:35)
3.1.2 制样方法简便，红外显微镜测试样品时，大多数条件下无需制样，对于薄膜状的固体样品，只需将它置于样品台上，如样品能透红外光，便可用红外显微镜的透射方式测定红外光谱。不易透光时，则改用红外显微镜的反射方式进行测量;对于微量固体样品，只需将它放在溴化钾晶片上，使用红外显微镜的透射方式，就能方便地测定其红外光谱;或用金刚石池将样品压薄，可获得高质量光谱。对于多组分的样品，也不需要预先分离。可以通过可见光显微镜选择好多组分样品中单组分部位，然后用红外显微镜的反射方式，测定样品中单组分部位的红外光谱。可对不同形态细胞或生物组织进行特定区域的红外光谱测定[13]。
3.1.3无损检验，在通常情况下，品样测试前未经制样处理，测试后品样的样品能保持其原来的形态和晶体结构，也未受到污染，能继续用于其它分析。
3.2 红外显微镜在肿瘤诊断上的应用
肿瘤的红外光谱分析，在分子水平上揭示癌变组织和细胞与正常组织和细胞的差别。通过对红外光谱的解析，可直接阐明引起图谱变化的主要原因。例如通过对宫颈癌的红外光谱研究，有如下规律：癌变细胞中，糖原含量大幅度下降 ;核酸分子中磷酸二醋基团的氢键结合力大为增高;蛋白质中某些氨基酸残基上C-OH基团的氢键遭破坏;细胞膜脂质中亚甲基链结构和有序性发生改变.而且从光谱分析还可对病程进展各期;正常→微小的病理变化→恶性期作出诊断。沈世杰等人应用傅里叶变换红外光谱对20例人乳腺病理样品进行了分析[14]。实验发现,乳腺癌组织与乳腺良性病变组织之间有较大的红外光谱差异。
4 红外图像技术在生物医学中的应用
4.1 红外图像分析原理
红外图像分析技术是在傅里叶变换红外显微镜技术的基础上发展起来的微区分析技术。红外显微图像分析有两种方式实现。一种是画地图(Mapping)方式 [15],它是将自动显微镜载物台逐点移动样品,测定样品上各点红外光谱,进行红外图像分析[16,17,18] ,如对样品中相应某一成分光谱中的特征基团谱带，计算积分面积，从而可获得样品上各点(如25mm ´25mm面积)某一成分含量分布图，它又称为图像分子化学。该技术使用单通道检测器,只能逐点扫描,数据采集时间很长,一般需要数小时之久。另一种红外图像分析新技术是焦平面阵列(Focal Plane Array)红外检测技术,这种技术以前仅用于军事侦。在焦平面阵列图像技术中，不再需要移动样品载物台来完成红外光谱的采集,且可对较大面积的样品进行红外图像分析。它是由多通道焦平面阵列检测器(如64×64单元MCT、128×128单元InSb,和256×256单元MCT检测器)、光学显微镜与配置步进扫描干涉仪的红外光谱仪组成(图1)。
对面积为600×600μm的样品,Stingray红外光谱图像系统，在空间分辨率为 3.5μm时,焦平面阵列的像素点(单元)可达到128×128个,在短时间内完成16384个像素点的红外光谱采集,分析时间约为7分钟。用步进扫描成像系统采集的多维数据集、数据处理和特征提取方法。
4.2 红外图像分析技术在生物医学中的应用
在生物学方面，L.H.Kidder等人利用红外图像分析技术研究了丰乳剂对人体乳房组织的影响，美国国家卫生研究院(NIH)已运用该方法来观察妇女乳房组织中的丰乳剂等人工添加物引起的硅酮胶(Silicone gel)渗漏问题，图3显示了人体乳房组织中硅酮包结物的红外图像和红外光谱[19]。E.N.Lewis等人应用红外图像分析技术对猴脑组织中蛋白质和磷脂成分的分布差异进行了研究[ 20]。
红外图像分析技术已用于展示病态与正常组织在化学组成上的区别，细胞层之间的新陈代谢差别，例如：在病理学组织的研究方面对复合硬化病人白质与小鼠球状细胞脑白质病变关系的研究、脑溢血、癌症组织以及对头发中滥用药物的检测等研究工作[16]。
Lasch等使用 Hyperion FT-IR imaging system，对前列腺癌变部位的切片进行了图像分子化学的研究，得到了酰胺I谱带成分的分布图，它与同一样品的的荧光染色图像(用于诊断)有相同的结果。随着图像技术的完善和数据的积累，红外显微图像技术可望成为新的医学诊断工具[21]。
参考文献
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21.P.Lasch, L.Chiriboga, H.Yee, M.Boese and M.Diem, Microscopy and Analysis, 2002,27:5(Asia/Pacific Edition)
Application of Fourier Transformation Infrared Spectroscopy and (Infrared ) Imaging Techniques in Biomedical Science Zhanjun SONG , Shijie SHEN , Xiaoguang ZHAO
National Center of Biomedical Analysis , 100850 , Beijing
Abstract Fourier Transform Infrared Spectroscopy ( FTIR ) has been applied extensively in biomedical science, it is quite effective for studying the biomolecular secondary structures and their interaction, because it can quickly determine molecular chemistry structures and concentration, such as protein, nucleic acid, bacteria and pharmaceuticals. Infrared imaging has been applied in the chemical composition analysis of living things cells and organs.
Key words Fourier Transform Infrared Spectroscopy, Infrared imaging, Protein, Nucleic acid ,Bacteria
红外光谱及其图像技术在生物医学中的应用