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【求助】10KD蛋白的电转膜条件
【求助】10KD蛋白的电转膜条件
最近做了western几次都做不出来，蛋白分子量在10KD，用的15%的SDS胶，
电泳条件是60V 30min，之后120V 1h。
之后采用湿转，设置电压100V 2h,之后发现内参b-actin出来了，但是目的没出来
问了抗体公司的客服人员，说是转膜时间长了，小分子量蛋白已经转没了
于是又使用了100V 90min，发现结果仍然是有内参，没有目的蛋白。
难道转膜时间还是长了？
给位高手有做过这个分子量的蛋白吗？指点一下经验。
一抗是4度过夜，二抗常温1h。
显影出来，内参正常，目的条带胶片上一片白板，顶多有个点。
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最新回复
moonlight45 (2014-1-06 17:36:27)
用的是PVDF膜，BIO-RAD的机子
fei1226com (2014-1-06 17:36:45)
曾经做过12.6KDa蛋白，转膜条件（湿转）恒压70V，2h以及恒流200mA，1h均可，针对你的条件可尝试100V，1h,内参肯定能转上，而目的蛋白也不会这么容易转过，如果还是没有，就该考虑转膜以外的因素了，其中很关键的一个就是你的一抗。
moonlight45 (2014-1-06 17:37:25)
谢谢楼上的朋友
我的一抗是刚订来的，是进口的，虽然不是大厂家，但也应该不会有什么问题。
现在主要考虑一下转膜的条件，如果还是做不出来，那就要考虑抗体的问题了。
刚搜索了一下论坛里的帖子，发现大家小分子量蛋白的缓冲液用的是不加SDS的，加甲醇
请问这个配方是怎样的呢？
fei1226com (2014-1-06 17:38:04)
QUOTE:
请问这个配方是怎样的呢？我们湿转时转膜液中一般都是不加SDS的,而甲醇是必须加的,量通常在100-200ml,我们在做12KDa时甲醇150ml,条带ok,转膜液中改加甲醇试试吧,有什么问题再交流!
huifeng0516 (2014-1-06 17:38:28)
楼主用的PVDF膜是多大孔径的？转小分子量蛋白要用小孔径的膜，如蛋白分子量在20KD以下时要用孔径0.22um的膜，如果用0.45um的膜就很容易转过，这是一个很重要但是又很容易被忽略的问题。
moonlight45 (2014-1-06 17:39:02)
fei1226com (2014-1-06 17:39:44)
一般在转大分子量蛋白时电转液里加入0.1%SDS 是为了增加转印效率，在转小分子时可以不用；另外，转小分子时电转液里的甲醇浓度最好提高到15-20%。
至于膜的孔径，0.45的也可以用，就是你的电流和时间要掌握好，我做过12kD的，湿转150mA45分钟，没问题。
祝你成功！
moonlight45 (2014-1-06 17:40:11)
谢谢，我打算试下楼上的条件转一下。
加甲醇是为了增加PVDF膜的吸附能力，那我是否可以多加一下呢？
fei1226com (2014-1-06 17:40:30)
转小分子量蛋白甲醇可适当多加,一般不超过200ml.
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