【求助】为什么溶包涵体后Ni柱仍然不能纯化

最新回复

• ritou1985 (2014-1-07 15:18:09)

  
  所有buffer中尿素浓度是否一样？

• ukonptp (2014-1-07 15:19:30)

  
  柱子有没有问题？颜色正常吗？都正常的话，应该是蛋白没有完全变性，改用6M盐酸胍溶解，然后上柱，上柱后，再改回尿素系统冲洗，洗脱。

• wmp1234 (2014-1-07 15:22:06)

  在得不到足够信息的情况下，往往比较难以分析，大家多是在假定一些信息来回答问题，这样有时候碰巧符合了，但也有推断错误的时候。这样对解决问题是不利的。
  如果不涉及到技术保密问题，关于蛋白质纯化问题都建议按下列信息来提问。
  1、建议贴张SDS-PAGE图来分析一下，最好包括：
  Marker，胶浓度，变性还是非变性
  诱导前
  诱导后
  破菌上清
  破菌沉淀
  沉淀洗涤上清
  变性溶解上清
  变性溶解沉淀
  柱纯化前
  柱纯化穿透
  柱洗脱
  等各个样品。
  2、建议把流程中的各个部分所用缓冲液说明一下，例如：
  破菌缓冲液
  破菌方法
  包涵体洗涤液
  包涵体溶解液
  柱平衡液
  柱淋洗液
  柱洗脱液
  柱洗脱方法
  3、建议说明纯化规模和纯化设备，例如：
  一次纯化所用的菌体量
  破菌缓冲液体积
  包涵体洗涤，溶解液体积
  纯化用柱类型
  纯化用柱大小
  柱淋洗液用量
  柱洗脱液用量
  纯化仪器
  4、建议适当说明目标蛋白的性质，例如：
  载体类型
  Tag类型、
  理论分子量
  理论等电点
  

• ero11 (2014-1-07 15:31:34)

  我的同学也用溶解包涵体纯化的方法制作抗体，因为所有纯化的buffer都加尿素会对柱子损伤很大，我同学就没有用加尿素的buffer，纯化结果就很好，所以我就没有采用带有尿素的buffer.
  而且蛋白已经变性，HIS标签已经暴露，个人认为用不用加尿素的buffer应该对纯化没有太大的影响吧？

• ero11 (2014-1-07 15:31:56)

  
  我的柱子用的是新的，而且我们实验室同学用都没有问题，所以可以排除是柱子的原因；
  同时我以前用过盐酸胍溶解包涵体，但是盐酸胍会跟SDS反应，还需要透析去除，所以比较麻烦，蛋白也很容易丢失，所以后来又改用尿素了

• ero11 (2014-1-07 15:32:35)

  
  我在尿素溶包涵体前后都有做SDS，上清明显有目的蛋白，而且量也很多，所以才会接着做纯化的
  都说蛋白所带电荷与亲和层析没有太大的关系，可是大家用的蛋白大部分都是等电点在五六左右，所以用PH是8.0的buffer，蛋白会带有负电荷，可是我的蛋白等电点是11.78，这样会使蛋白带有正电荷，会不会是由于蛋白的电荷与NI离子的正电荷的排斥力量影响结合呢？
  只是个人想法，不知道对不对！请高手指教

• ero11 (2014-1-07 15:33:36)

  
  我的方法是：先将沉淀用0.5M Nacl洗涤沉淀，离心后，将沉淀加入适量溶包涵体的溶液（20mM Tris-Hcl(PH 8.0)、0.5M Nacl、20％甘油），4度放置30min，离心（20000g，20min）分离出上清沉淀，SDS，上清目的蛋白含量明显增多后，过柱

• gogo (2014-1-07 15:33:54)

  
  个人觉得您包涵体纯化的文献看的不多，您可做一下以下几个方面的改进：
  1.洗涤的改进，包涵体纯化最关键的就首先就是包涵体的洗涤，您只用NaCl洗是不行的，您可以随便找片文章上都有怎么洗的方法，洗的包涵体的颜色越正，越白，越好，这样对后续的变性，纯化更有利！一般洗过后，跑胶的话，纯度能达到95%以上，没有特殊需要是不需要再过镍柱进行纯化的。蛋白纯化的宗旨就是越简单越好！
  2.变复性的改进，这个您没写，但我从您洗涤来看，估计您也不会做的很完善，您可随便找片文章参考下。
  祝好运！

• huifeng0516 (2014-1-07 15:34:29)

  我的蛋白是带有His标签的膜蛋白，细菌培养IPTG诱导后总愿意形成包涵体，用6M尿素溶解后20000g离心20min后，上清中出现明显的目的蛋白，SDS和WESTERN的结果都很好，但是用Ni离子亲和层析柱却不能纯化出我的蛋白。我的蛋白等电点是11.78，但是理论上亲和层析应该跟蛋白带的电荷没有关系吧！
  纯化过程：1、平衡柱子；2、将上清加入柱子中，同时接流出蛋白；3、10ml wash buffer洗柱（含30mM咪唑）4、elusion buffer(含200mM咪唑)
  所有buffer的PH均为8.0
  将2和4步所接蛋白做SDS和WESTERN，只有第2步中样品有目的蛋白，第4步的所有样品电泳没有蛋白，胶上很干净
  按理论，尿素溶包涵体后蛋白质已经变性，没有空间结构，WESTERN有结果，纯化就没有理由不出结果的啊！
  实验停滞，很需要各位的帮忙！
  
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  膜蛋白不好做，常有不挂柱的时候。等电点为11以上，用阴离子交换很好。
  把包涵体溶解buffer，柱平衡buffer，淋洗buffer，等等都讲得更清楚些。
  加个整个破菌、溶解、纯化过程的电泳图来看看。
  WESTERN是SDS电泳后的检测，是SDS起了溶解的作用，与尿素溶解情况并不相同。

• huifeng0516 (2014-1-07 15:34:50)

  我的同学也用溶解包涵体纯化的方法制作抗体，因为所有纯化的buffer都加尿素会对柱子损伤很大，我同学就没有用加尿素的buffer，纯化结果就很好，所以我就没有采用带有尿素的buffer.
  而且蛋白已经变性，HIS标签已经暴露，个人认为用不用加尿素的buffer应该对纯化没有太大的影响吧？
  
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  “因为所有纯化的buffer都加尿素会对柱子损伤很大”
  有什么损伤呢?放心去用吧，没有多大问题的。
  “我同学就没有用加尿素的buffer，纯化结果就很好，所以我就没有采用带有尿素的buffer”
  那是他的运气比较好，他的蛋白在柱上完成了复性或者说去除尿素而没有沉淀的过程。
  “而且蛋白已经变性，HIS标签已经暴露，个人认为用不用加尿素的buffer应该对纯化没有太大的影响吧？”
  你的蛋白不一样，很有可能会沉淀在柱上。

• huifeng0516 (2014-1-07 15:35:22)

  我的柱子用的是新的，而且我们实验室同学用都没有问题，所以可以排除是柱子的原因；
  同时我以前用过盐酸胍溶解包涵体，但是盐酸胍会跟SDS反应，还需要透析去除，所以比较麻烦，蛋白也很容易丢失，所以后来又改用尿素了
  
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  尿素也需要透析去除的啊，透析不是很麻烦吧。扎个袋袋，扔在烧杯中过夜好了。
  蛋白容易丢失是什么意思？

• huifeng0516 (2014-1-07 15:36:00)

  我在尿素溶包涵体前后都有做SDS，上清明显有目的蛋白，而且量也很多，所以才会接着做纯化的
  都说蛋白所带电荷与亲和层析没有太大的关系，可是大家用的蛋白大部分都是等电点在五六左右，所以用PH是8.0的buffer，蛋白会带有负电荷，可是我的蛋白等电点是11.78，这样会使蛋白带有正电荷，会不会是由于蛋白的电荷与NI离子的正电荷的排斥力量影响结合呢？
  只是个人想法，不知道对不对！请高手指教
  
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  Ni柱纯化与高等电点没有直接关系，至少我做过很多碱性蛋白过Ni柱都可以。

• huifeng0516 (2014-1-07 15:36:40)

  我的方法是：先将沉淀用0.5M Nacl洗涤沉淀，离心后，将沉淀加入适量溶包涵体的溶液（20mM Tris-Hcl(PH 8.0)、0.5M Nacl、20％甘油），4度放置30min，离心（20000g，20min）分离出上清沉淀，SDS，上清目的蛋白含量明显增多后，过柱
  
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  洗涤可以再做些工作，可以看看相应的文章，如搜索一下包涵体洗涤。
  溶包涵体的buffer中没有变性剂？如尿素、盐酸胍？
  溶解不是4度放置30min，而是磁力搅拌溶解，30min似乎也不够，我们常常overnight，再加超声。

• huifeng0516 (2014-1-07 15:37:25)

  个人觉得您包涵体纯化的文献看的不多，您可做一下以下几个方面的改进：
  1.洗涤的改进，包涵体纯化最关键的就首先就是包涵体的洗涤，您只用NaCl洗是不行的，您可以随便找片文章上都有怎么洗的方法，洗的包涵体的颜色越正，越白，越好，这样对后续的变性，纯化更有利！一般洗过后，跑胶的话，纯度能达到95%以上，没有特殊需要是不需要再过镍柱进行纯化的。蛋白纯化的宗旨就是越简单越好！
  2.变复性的改进，这个您没写，但我从您洗涤来看，估计您也不会做的很完善，您可随便找片文章参考下。
  祝好运！
  
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  包涵体洗涤确实是纯化过程中比较关键的步骤，它不仅是去除杂质的过程，而且往往会对后续的柱纯化吸附起作用。
  靠包涵体洗涤达到SDS-PAGE纯度95%以上是个例，不具有普遍性，这和重组蛋白的表达量有很大关系。高表达量往往包涵体的纯度也越高，只是相对变化而已。

• 8princess8 (2014-1-07 15:38:21)

  想问问各位高人，我的蛋白是重组抗原变性纯化后能包被作ELISA吗？ 变性后抗原表位发生改变势必会影响与特异性抗体结合吧？