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【求助】ERK的问题
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我做了很长机间的ERK了，但一个影子也没见到，大家帮我看看是什么原因，先谢谢了，一下是我的试验过程：
1.细胞提蛋白：25瓶一瓶加300微升裂解液（提总蛋白），加蛋白酶抑制剂，磷酸化抑制剂，超声波破碎（常温）3分钟，显微镜下看见细胞裂解，收集后离心，取上清。
2.电泳：电泳的过程应该没问题，因为做其他蛋白做的很好。
3.封闭：小牛白蛋白也曾用过商品化的封闭液
4.孵一抗：一抗以说明书的比例配制（也曾扩大和缩小比例）4度过夜，漂洗三次，每次6分钟。抗体也换了两种了（一抗识别位点是络氨酸和丝氨酸）
5.二抗：二抗孵育室温1---2小时不等，二抗可以识别其他蛋白的，应该可以的。
6.每次曝光显影都是白板，
各位大侠处处主意，看看我有没有原则性的错误啊!
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【求助】ERK的问题
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最新回复
INK (2014-1-08 15:18:35)
QUOTE:
1，检测二抗是否有效2，一抗是哪个厂家的？
zhezhe (2014-1-08 15:19:08)
一抗是cell signaling的，建议浓度1：1000我按1：600配的
二抗做别的蛋白可以做出来
INK (2014-1-08 15:19:32)
QUOTE:
ERK这种蛋白应该很好做蛋白在提取等操作过程中自己感觉有失误的步骤吗？
zhezhe (2014-1-08 15:19:52)
没觉得，我每次做都是按说明书做的，并且做其他蛋白的时候条带也很好的
只是做ERK一直没影子
INK (2014-1-08 15:20:15)
QUOTE:
ERK好做的一个蛋白你再试试呗
不行就换抗体了
zhezhe (2014-1-08 15:20:34)
好的
我已经换过一次抗体了
呵呵
谢谢你的解答啊
cwcwcww (2014-1-08 15:21:07)
不知道你存在的问题跟我们的是否一致，但是我们实验室曾经有一阵子也出白片，找了好长时间的原因，后来是PBST/TBST和PBS/TBS 的PH值偏酸，正常来讲是应该7.2-7.4之间，如果PH偏酸，不利于蛋白与抗体的结合，不知道你们是否也这个问题，你可以测一下，希望对你有帮助
zhezhe (2014-1-08 15:21:45)
我每次配制的过程中都用PH仪和PH试纸测试，应该没问题的，liujia5708 你们用多大胶跑的？
flower-201 (2014-1-08 15:22:25)
先做非磷酸化的总ERK，如果出来了再做p-ERK。
另外，你的膜剪切的位置对不对，ERK应该在42-44kd附近。建议剪膜时宽一点剪。把20-100kd 的膜都包括进来看看。
zhezhe (2014-1-08 15:22:49)
bring (2014-1-08 15:23:12)
ERK还是很好发的，我以前就用cell signal的，开始还是很好做的，放久了就不行。还是从头回顾下试验过程。不过总ERK 没发出来，我觉得首先应该考虑试剂问题。还有就是您是哪里的？如果是武汉的，我想试试您的cell signal的抗体，如果我试着还可以，您可以转售些给我。
zhezhe (2014-1-08 15:23:37)
QUOTE:
谢你的好意，我现在用的就是CST的抗体。就是一直没做出来。bring (2014-1-08 15:24:01)
zhezhe (2014-1-08 15:27:53)
QUOTE:
我是一周前回来新的，用了效果也一样，做不出来。能把你们的详细步骤发一份给我吗？谢谢。
8princess8 (2014-1-08 15:28:11)
你的一抗和二抗都是什么来源的？说一下。还有你的细胞是什么来源的？
zhezhe (2014-1-08 15:28:29)
8princess8 (2014-1-08 15:29:32)
kuaizige (2014-1-08 15:29:49)
我们实验室一直在做erk，没有做不出来的时候。
你可以先用库玛丝蓝染一下胶，看看42/44的蛋白带怎么样。
我们用脱脂牛奶block一小时就可以了。
然后呢把一抗浓度提高，我们是1：500，可以冻在-20度用好几次呢。
如果还不行，那就是抗体有问题。
还有就是抗体用之前要混匀一下。
Good luck！
zhezhe (2014-1-08 15:30:12)
我从一个朋友得到点抗体ERK做出来了，现在正在做磷酸化的ERK，应该注意点什么，各位大侠给点建议啊，先谢谢了。
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