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【求助】ELISA结果分析:为什么样品稀释后的OD反而高
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用DBI的核蛋白抽提试剂盒,样品分别2倍,5倍稀释.RD的ELISA试剂盒测定NFKB P65
但测定结果为什么5倍稀释的OD值反而高?几个样品都存在这种情况,实验已经两次重复,而且标准曲线很好.
非常困惑中,初做ELISA,请高手指点...
在线等待,不胜感激....
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最新回复
ending (2014-1-08 15:32:12)
我想可能两倍稀释时有其他杂质和包被的样品反应了，而这种杂质有不和最终的结合物质反应。
Ao7 (2014-1-08 15:32:29)
谢谢楼主回答.你是说样品的问题,存在非特异结合,对吧.
可是我不同处理间的趋势很好,这样的数据可以用吗?
还有什么好办法解决这个问题?
继续求助中.....
KGZ564 (2014-1-08 15:32:48)
样品是样品稀释液稀释的，所以不应该存在样品污染的问题。
ELISA测定的时候，存在着一个线性范围的。当第一抗体被抗原饱和后抗原浓度增加不会提高被捕获靶抗原的量，所以样本中靶抗原浓度在一定范围内是线性相关。在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物（沉淀）的量呈现一个曲线。曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带。
可能你样品中抗原量过多了，超过了抗体的结合能力，所以出现稀释后，OD增大现象。我觉得稀释后的数值可能更加可信。
Ao7 (2014-1-08 15:33:12)
多谢楼主.
5倍稀释后的OD在0.2左右,那我再稀释一下,8倍或者10倍,测定看看.理论上两次测定的值应该差不多的.实际上是否有这样的量化关系呢,请高手指教...
zwsyrt (2014-1-08 15:33:31)
稀释两倍并不代表在包被的时候，吸附的蛋白就会比稀释5倍的高，从你的实验结果来看，应该就是这个问题了。也就是说，你的稀释倍数影响了蛋白的包被效率，从而导致实验结果与预期的不一致，此外，也不应该说稀释两倍，蛋白浓度高就一定能包被相同量的蛋白上去，反而稀释5倍就一定低，楼主做这个实验只能证明你的蛋白在稀释5倍的条件下，包被效率更高，并不能说明其他问题。
panda王 (2014-1-08 15:33:53)
QUOTE:
板孔所能吸附的蛋白量是有限的过多的蛋白进行包被的话，反而可能因为蛋白浓度过高，导致抗原表位被“block”，从而降低了后面抗原抗体复合物形成的量，OD值不仅不会升高，相反会降低。
Ao7 (2014-1-08 15:34:29)
多谢两位的回答。
我做这个实验是检测下不同处理条件对NFKB P65表达的差异。只是在测定时每个样品采用了两个稀释倍数。但对于同样的稀释倍数下，不同处理间的差异很显著，难道不可以说明不同处理条件下该因子的表达是有差异的？
“楼主做这个实验只能证明你的蛋白在稀释5倍的条件下，包被效率更高，并不能说明其他问题。”是什么意思呢？在不超过板孔最大吸附量的情况下，包被效率直接反映的是蛋白浓度，对否？
另外还有一个问题，各位高手做ELISA时设置阴性对照吗，考虑样品提取液是否对结果有影响呢？
H2O (2014-1-08 15:34:56)
QUOTE:
其实表达差异应该用RT-PCR来做，而不是用ELISA，当然ELISA在一定程度上也可以定量，就看你提取的目的蛋白的纯度了，因为抗原包被存在一个过量包被的过程，在板孔里面能包被上的并不一定全部是你的蛋白。但是如果你所买的试剂盒中已经包被了一抗，那么你就可以对你的表达目的蛋白进行定量检测，这样可以从OD值中反映出你表达蛋白的浓度。你只是做反了。。。ELISA不需要做阴性对照，因为这是严格的抗原抗体反应，并不是非特异性交联。不过需要做的是阳性对照，这样可以对你的样品孔进行定量检测。
一般我们包被时，在板孔里加入蛋白的量都是过量的，这样保证蛋白能够被吸附上去，因此包被效率只是相对板孔质量而言，（当然，这只是我个人理解，如果有不对的地方，请各位战友批评指正）。
样品提取液只是对你提取蛋白过程中，所能得到的目的蛋白的总量有影响，一般最后溶解目的蛋白的量时，请参照标准程序或试剂盒，无需担心！
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