【求助】2D求助

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• gemei0115 (2014-1-09 11:38:49)

  
  你点mark了吗,好像没有啊！我也刚做2D，但我看你的蛋白提的不纯啊！有横条纹。

• 9900 (2014-1-09 11:39:16)

  
  什么样品哦？
  从图上看的话 首先样品制备不好 其次有横拖 可能是样品问题也可能是第一向聚焦不完全
  再图中有垂直方面的空白 可能是转第2向的时候有气泡 也可能是由于样品制备的问题导致。
  另外从图中看蛋白分布区域比较集中 建议改换相应得PH范围的胶条

• dragonkilly (2014-1-09 11:39:51)

  你点mark了吗,好像没有啊！我也刚做2D，但我看你的蛋白提的不纯啊！有横条纹。
  
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  先解释一下，由于是新手，我在做图的时候反了，其实该图的右方才是胶的正上方，左方是胶的下面。这样说来那些都不是横条纹，而是纵条纹了，应该是二相的时候有问题。
  另外我没有点marker，可能是组织蛋白，感觉确实杂质比较多啊，那一坨结构蛋白掩盖了很多点。
  

• dragonkilly (2014-1-09 11:40:17)

  什么样品哦？
  从图上看的话 首先样品制备不好 其次有横拖 可能是样品问题也可能是第一向聚焦不完全
  再图中有垂直方面的空白 可能是转第2向的时候有气泡 也可能是由于样品制备的问题导致。
  另外从图中看蛋白分布区域比较集中 建议改换相应得PH范围的胶条
  
  ===========================================================================================================
  
  多谢师兄指教。正如我刚刚给楼上那位师兄说的那样，我在做图的时候方向没有弄对。这样说来可能那些横拖就应该是纵拖了，属于第二相的问题，那第二相的时候出问题的大概方向是什么呢？
  另外按照上面的说法，那些空白是否应是水平方向的空白，也就是说在水化上样的时候有气泡么？我记得当时我在水化上样的时候确实产生了一些气泡，但是没有办法弄掉，然后一个师姐告诉我水化过夜时间比较久，应该会很均匀了，那些气泡没有什么问题的，不知这一点是否真的有影响，期待师兄解答。
  至于胶条的话我用的是PH3-10的，范围应该很大了。
  最后这个样品做的是某妇科组织，制样可真费时间啊！

• kulee (2014-1-09 11:40:37)

  
  按照你说的方向看的话的确是有很明显的垂直方面的空白 应该是气泡的原因 一般情况下我作水化的时候都是从下午水化到第2天早上的 感觉在水化过程中注意点就应该没问题了 不过看你2张图那空白带位置都一样 可能是样品本身就这样
  另外你是用的银染么？是的话感觉背景有点脏 建议用考染Blue silver
  再是关于你那几个高丰度蛋白点的问题 看你胶条的蛋白分布 2端蛋白点比较少
  建议你用3-10NL的胶条 如果目标蛋白在中间区域可以用4-7的胶条试试

• dragonkilly (2014-1-09 11:41:09)

  QUOTE:

  原帖由 kulee 于 2014-1-9 11:40 发表
  
  按照你说的方向看的话的确是有很明显的垂直方面的空白 应该是气泡的原因 一般情况下我作水化的时候都是从下午水化到第2天早上的 感觉在水化过程中注意点就应该没问题了 不过看你2张图那空白带位置都一样 可能是样品 ...

  我用的就是3-10NL的胶条，另外这张我用的也是考染，后来用PS做成黑白的来看的。当时由于是我自己一个人在弄，结果用的考染液中很多沉淀，也不知道对背景有没有影响。
  另外我觉得里面那些低丰度的点虽然很少有拖带的现象，但是看起来还是比较模糊，不知道怎样改进。
  下面是我第二次跑出来的图片，感觉高峰度蛋白那一片少了很多，可能和制样有了些经验有关，而且第一次跑出来空白的地方这次也有很多低丰度的点了，估计也是和制样有一定关系。但是总体感觉点还是比较少，不知道是否还是和蛋白丢失比较多有关，如果下次要再跑2D的话还需要注意哪些问题呢？请指教，非常感激。

  
  86277440.jpg

• kulee (2014-1-09 11:41:29)

  
  我看你这2张图的话 我绝对点不算少了 拿去用软件分析的话估计可以的
  而且从图中直接看都能发现很多差异点了
  蛋白丢失总是有的 不论怎么制备总会有蛋白丢失 只要能找到需要的点就行了
  我做植物的 也不清楚你这块蛋白制备的方法 你想继续改进的话 建议多找找制备方法。。
  其它的步骤起始都是比较简单的 再一点就是干净。。。
  做2D感觉啥都要干净的好。。

• avi317 (2014-1-09 11:41:59)

  
  另外再请教一下各位高手，我这个组织的上样量是2.5mg，17cm，PH3-10NL的胶条，考染，如果把上样量减少一点高峰度蛋白那一块会不会显得小一点，背景也浅一些，图的质量高一些呢？谢谢

• plaa (2014-1-09 11:42:19)

  有没有什么试剂盒可以去除你的高峰度蛋白的阿？感觉影响非常大阿！

• dragonkilly (2014-1-09 11:42:43)

  QUOTE:

  原帖由 plaa 于 2014-1-9 11:42 发表
  有没有什么试剂盒可以去除你的高峰度蛋白的阿？感觉影响非常大阿！

  相关疾病：
  头痛
  有没有什么试剂盒可以去除你的高峰度蛋白的阿？感觉影响非常大阿！
  我也很为这些高丰度蛋白头痛，我也想请教这个问题