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【求助】我的WB系统到底哪里出了问题－－已出条带
刚学做WB，但是暑假一直就做这个实验，从开始准备到现在三个星期了，始终没有条带，连内参也没有做出来。这说明我的系统有问题，高手帮我看一看，那个“它”到底在哪？【求助】我的WB系统到底哪里出了问题－－已出条带
下面是我的步骤（尽量详细）
我的目的蛋白大小为92KD，内参GAPDH 36KD.
一）制胶
分离胶--8%，积层胶--5%，配方按分子克隆进行，其中两种Tris（6.8和8.8）用PH计调PH值。论坛上关于制胶的注意事项（气泡，压胶，梳子，漏胶，保湿等等）基本都有注意到，现在配胶基本上不会出现什么状况，两层胶之间分隔线很平直，梳子拔除后梳孔整齐无异。从后面跑胶的情况看，我的制胶应该是好的，因为每次MARKER都跑得直，分离得好，而且用0.1%考马斯亮蓝染胶可见清晰的分离条带，深浅不一，平整匀称。
二）样品制备
我提的是小鼠皮肤，新生小鼠(1周左右）断颈处死后立即取下皮肤全层，液氮研磨成粉后收集于裂解液中（裂解液和PMSF都是碧云天的），冰上半小时（每隔10分钟颠倒摇匀数次）离心后收集上清，BCA法测浓度，一般在2－5ug/ul左右。将适当体积样品与1*SDS上样缓冲液混匀于PCR仪上100度变性4分钟。
三）加样电泳
加样试过不同的蛋白量（几十至上百微克都有试过）。电泳，积层胶60V，由于两种胶之间浓度相近，样品一般要进入分离胶一会后才会看到被压成一条线（这个过程一般在20分钟左右），此时转换电压至100V (这样做没什么问题吧)，当最前沿蓝色至凝胶最底部一般总耗时1小时10分左右（这个速度快了吗？但预染的Marker每次都跑得好好的）。
四) 转膜
说起转膜我是最揪心的，PVDF膜，先用0.45um, 现改用0.22um ,湿转，（48mmol/L Tris,39mmol/L 甘氨酸，20%甲醇 0.0375% SDS）,BIORAD转膜仪，三明治法，恒流200mA（这个一直都没变过）,转膜液中放冰盒，转膜缸用冰包围（非包埋） 转膜时间一改再改，最开始用2个半小时转，发现有些分子量小的Marker比较淡，丽春红S（碧云天，新买的）染膜没有条带，怀疑转过了，改成2个小时，Marker很清晰，很亮，丽春红S仍然染不出（考马斯染转过的胶没条带）接着往下做WB，内参和目的都做不出来，仍然怀疑转过了，心想Marker颜色残留在膜上了。后来又1个半小时，1个小时转，结果同上。至昨天换了0.22的膜，用两层，湿转20分钟，取出其中一个带Marker的揭开一看，两张膜上存有Marker颜色，胶上好像也有点残留，心想这下肯定没跑掉吧，膜上肯定有蛋白，但是丽春红依旧染不出，至此不相信丽春红S染色。考马斯染胶4度过夜，同时其他的几个没取出的胶和膜就放在转膜仪里没动，过了一夜（这样可能不符合规范，但是夹子夹着，又没接通电源，蛋白应该跑不了吧）第二天将他们取出往后做，依然没有，内参和目的都没有。
五）免疫反应
转膜后，去离子漂洗一次，
5%脱脂奶粉室温封闭1小时。
一抗（1：1000 5%脱脂奶粉配）37度 2小时（或4度过夜） TBST 摇洗3*10分钟
二抗（1：1000 5%脱脂奶粉配）37度 1小时 TBST 摇洗3*10分钟
DAB显色（北京中杉）
诸位，到底问题在哪啊？
膜刚买不久，不到1个月。内参抗体上个月别人用是好的，一直放于4度。
另：我的转膜是不是应该调到100mA 1小时左右。是不是膜上看到预染Marker就一定代表转膜成功了？
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最新回复
S6044 (2014-1-09 11:44:19)
从你的描述来看，转膜是没得问题的啊，一般情况下，只要预染marker能够转上，像你说的，比较小的都转上了，如果有目的蛋白的话，应该不会出问题的。我原来做这样大小蛋白的时候，用0.45um的PVDF膜，100V转一个半小时就可以的啊。建议你做个阳性对照看下，是不是样品制备的时候出问题了。
红茶可乐 (2014-1-09 11:44:57)
QUOTE:
胶的做过，转膜之前样品分离很好（不是每次都做，样品一起变性后放在-20度，一般不超过一周），转之后只有上次将时间缩短至20分钟才在胶上染出残余条带，先前的都转得很干净。你是说膜的考染吗？膜做过考染，感觉膜不像胶那样易洗净，洗很久仍然很蓝（洗脱液：甲醇250ml,乙醇70ml，去离子水定容至1L。）上次做（转膜20分钟）发现膜上有模糊痕迹，但是难以看清条带。
另外，请问一下，我的抗体孵育方法是不是有问题：我的一抗二抗都是用5%脱脂奶粉配，孵育时将一定量稀释好的抗体加到干净玻片上，然后将膜贴上去，再在膜上面加一定量稀释好的抗体，然后用与膜相同大小的塑料盖上，放到湿盒内。由于4度冰箱和37度孵箱里都没有摇床，所以只是静置放置，这样没事吧。抗体的量应该是够的，也没有干过。
popo520 (2014-1-09 11:45:15)
你一抗二抗延长一点时间试试：
比如 一抗 4度过夜； 二抗常温2~4小时。
另外PBST清洗的时候 用3* 5 min 吧 试试 good luck
红茶可乐 (2014-1-09 11:45:37)
QUOTE:
谢谢！一抗过夜和37度2小时都做过。
延长二抗时间和少洗，这次试一下。
owanaka (2014-1-09 11:45:58)
“同时其他的几个没取出的胶和膜就放在转膜仪里没动，过了一夜（这样可能不符合规范，但是夹子夹着，又没接通电源，蛋白应该跑不了吧）第二天将他们取出往后做，依然没有，内参和目的都没有。”
我认为一夜的时间蛋白会自由扩散开来，前面的浓缩效应一点儿也体现不出来。
再者，二抗的种属是否对应，如果一抗是兔抗鼠，二抗就要是羊抗兔或其他抗兔；二抗的效价你也要摸索；DAB的配置是否正确，操作时注意避光；丽春红的敏感性低，染不出来也没事；实在不行，就让别的同学在做实验的时候让他帮你上一个你的蛋白，一抗，二抗都用你的，只要他的目的蛋白有条带，你的试剂如果没有问题的话也会出现条带的
S6044 (2014-1-09 11:46:19)
我还是觉得原因可能出现在两个地方，一个是你的样品制备，因为你的内参都没有结果的嘛，其次是你的抗体属性，是不是和你的目的蛋白特异性的结合。
红茶可乐 (2014-1-09 11:46:48)
QUOTE:
谢谢！你说的第一点我也有担心。二抗的种属没有错，效价已经很高了（1：1000，说明书推荐1：5000－－1：10000）。让别人试一下是个好建议，谢谢！
红茶可乐 (2014-1-09 11:47:07)
QUOTE:
谢谢！我也担心过样品，但是样品质量除了跑胶后考染，还有什么方法可以检验样品质量，之前提取蛋白后未变性直接冻于-20度，过两天融解后见沉淀，后来有人建议变性后保存，照做，请问变性后的蛋白分装冻存以后，取出再用时需要什么处理吗？离心？加热(园子里好像有人这么说)？还是其他措施。milkdog (2014-1-09 11:47:29)
DAB敏感性较差
建议换用ECL
红茶可乐 (2014-1-09 11:47:52)
QUOTE:
谢谢！想到一起去了，昨天已经和一同学联系上，今天用ECL去染一下。eve_49 (2014-1-09 11:48:10)
电泳的时候加预染marker
nvdabing (2014-1-09 11:48:30)
楼主，有时间的话把你变性好的样品2000rmp，甩一下，看看有没有沉淀？告诉我一下结果，再来分析你的实验。
红茶可乐 (2014-1-09 11:48:59)
结果回报：
这两天采用ECL发光底物检测，虽然背景很深，但是可分辨内参条带。两种目的蛋白有一种也有带。
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