【求助】超声破碎时，只有菌液变澄清时才算破碎成功吗？

最新回复

• avi317 (2014-1-09 16:58:25)

  
  溶菌酶加超声的话作用应该是很强的啊

• wmp1234 (2014-1-09 16:58:42)

  
  我最近也在破碎菌 ，我一开始用的200W，1S,3S，400-600次，超完后菌液仍然是乳白色，无明显变化。后来改用过200W，10s,30s ，90次，停30分钟，三次循环，菌液颜色无明显变化，但是镜检发现基本破碎完全。一次，我就用溶菌酶破碎，4度放置一天，然后来纯化我的蛋白，也纯化到了，所以今天也只用了溶菌酶没有超声。

• avi317 (2014-1-09 16:59:06)

  
  是的
  溶菌酶对付大肠杆菌是足够的
  就是会引入溶菌酶而已

• wmp1234 (2014-1-09 16:59:26)

  
  不过也有时候也纯化不到

• ritou1985 (2014-1-09 17:00:23)

  
  如果超声的话，溶菌酶有没有问题不大
  其实我觉得有时候跟蛋白有点关系，我同时表达GST和GST标签蛋白，结果GST一超就澄清了，而融合蛋白超了很久也没有澄清。后来怀疑是不是包含体，再后来改为低温长时间诱导，就可以了。
  不过倒不推荐长时间超声，如果不期望产量最大的话，一般超声哪怕没有澄清，蛋白量也是比较客观的了。

• glass (2014-1-09 17:01:37)

  
  我们表达GST融合蛋白，用200W 3S 3S 十分钟。最后菌液也是没有明显变化，跑胶看是在沉淀中，准备下次低温诱导试试，另外，楼上的各位超声这么长时间不会把蛋白打碎吧？以前看别人用超声只是打几秒，还以为我们用的功率就够大了呢，汗。

• ritou1985 (2014-1-09 17:01:56)

  
  ls的你是包含体表达啊，挺麻烦的，要搞蛋白复性的。
  如果你要做抗体的话还好，如果要是需要有活性的蛋白还真不容易弄。

• wmp1234 (2014-1-09 17:02:54)

  
  建议最好按要求先加溶菌酶，然后超声，溶菌酶使细菌温和破碎，避免机械性破碎从而避免GST标签蛋白的断裂，超声次数和时间建议尽可能的少和短，如果菌液很浓，根本很难达到别人所说的澄清状态，少超几次只是可能得到的蛋白少一点，但超多了就会影响GST标签蛋白，纯化时就很难挂柱了。

• INK (2014-1-09 17:03:14)

  “如果超声的话，溶菌酶有没有问题不大
  其实我觉得有时候跟蛋白有点关系，我同时表达GST和GST标签蛋白，结果GST一超就澄清了，而融合蛋白超了很久也没有澄清。后来怀疑是不是包含体，再后来改为低温长时间诱导，就可以了。
  不过倒不推荐长时间超声，如果不期望产量最大的话，一般超声哪怕没有澄清，蛋白量也是比较客观的了。 ”
  我现在也遇到了这个问题，表达后的菌液一开始是乳白色，400W功率，超声20min后都基本没变化的。我用的是pET-32a的载体，以为是包涵体表达所以就像上面这位仁兄说的改为低温长时间诱导，可结果还是一样，菌液无法澄清。中间换过两次细菌裂解液也没起作用。我得到的沉淀跟上清分开跑胶，结果，沉淀中杂带很少，甚至就一条带，而上清中却很多杂带，几乎就看不到我的目的条带。请问各位有没有什么好的建议？
  

• purrr (2014-1-09 17:03:54)

  确定破菌的效果应该不是看澄清与否吧？
  可以通过测OD值来确定。
  如果电泳上清的量特别少的话而沉淀里又有很明显的条带，那么应该是沉淀表达了，如果还不确定或者还寄希望于上清，那么最好做个WB检测一下。
  如果超声后在沉淀，也不一样就是包涵体，有可能是你使用的裂解缓冲液不适合，换其他的试试吧。
  如果还是改变不了，又不想做复性，那么可以换一下其他的标签试试，最好是分子量小一点的。或者干脆用个native的。
  Good luck!