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【求助】WB做不出P38和BCL-2

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-1-09 17:06    作者: linlinstar    来源: 分析测试百科网

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【求助】WB做不出P38和BCL-2
我在做WB事，内参和其他的BAX，ERK，JNK，Survivin每次都能做出来，结果还不错，唯独P38（cst）和BCL-2（Santa Cruz）做了好几次了都做不出来，，我第一次用5%封闭液（脱脂奶粉+TBST)稀释的一抗浓度为1：1000，二抗也是1：1000，后来bcl-2升到1：600还是在暗室中一点光都看不到，请教各位前辈这会是什么原因，是抗体出问题了，还是有其他问题?万分感谢
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最新回复

  • BUK (2014-1-09 17:07:15)


    不知道你的上样量是多大，你加大上样量试试，有些蛋白表达不多。祝你好运！

  • linlinstar (2014-1-09 17:07:51)

    我上样量是30ug

  • BUK (2014-1-09 17:08:23)

    有点太小了
    我们有时候上样量达到150-200ug

  • wood533 (2014-1-09 17:08:43)


    你的上样两足够。别的我不敢说，就是p38来讲，上样10ug足够了，我一般上样量5ug也能检出很好的条带（也可能与我用的CST的抗体有关）。另外，你检测的是磷酸化的p38还是总p38？如果是磷酸化的p38检测，那还需要诱导细胞才行，因为正常状态下细胞是不表达磷酸化p38的。再有一点就是，如果你用的细胞是来自大鼠或者小鼠的细胞的话，2抗不能选用mouse anti-1抗的。应该选用rabbit anti-1抗的2抗。

  • any333 (2014-1-09 17:09:11)

    我检测磷酸化的P38,用lps处理过的，这样诱导细胞没问题吧？我上样30ug，一抗浓度1：1000（cst的），二抗浓度1：2000（santa的），做不出条带。但是marker和内参可以做出来。
    是我诱导细胞有问题吗？

  • 66+77 (2014-1-09 17:09:30)


    你诱导的什么细胞，LPS的sigma编号以及浓度是多少，刺激时间是多少？

  • applebook=213 (2014-1-09 17:09:53)


    这位战友，在暗室中看不到光不代表检测不到，请问你压片时间是多少？如果看不到光至少要压5分钟时间。有的时候是要压10分钟以上才有条带显示。你之前检测的可能抗体效价高，也可能细胞表达量多，所以在暗室中就能看见。不能以此为判断标准的。
    建议：压片时间增长，上样量增加。
    另外还要建议的是如果你检测的条带在暗室中可以看见的话压片时间要很短才能看出差异，时间不好掌握，最好是把蛋白量减少再摸索压片时间。
    最后祝实验顺利

  • mysmdbl (2014-1-09 17:10:15)

    你诱导的什么细胞，LPS的sigma编号以及浓度是多少，刺激时间是多少？

    ===============================

    RAW264.7,浓度100ng/ml,24h,国产的lps

  • linlinstar (2014-1-09 17:10:37)


    是总P38，兔二抗

  • linlinstar (2014-1-09 17:11:07)


    我看不到光，压片10分钟以上有的
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