【求助】SDS-PAGE 条带分层问题

最新回复

• 831226 (2014-1-10 17:44:51)

  
  我也遇到过这种情况.感觉是浓缩胶配的有问题.而和电泳条件,样品没有直接关系.

• hot_hot_hot (2014-1-10 17:45:12)

  可以重新配下电极缓冲液试试，电极缓冲液使用次数多的话也会出现那种情况

• shkudo (2014-1-10 17:45:32)

  关键电极液都是新配的，蛋白浓度低，上样体积大的时候需要注意什么呀？

• hold住 (2014-1-10 17:45:55)

  QUOTE:

  原帖由 shkudo 于 2014-1-10 17:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  关键电极液都是新配的，蛋白浓度低，上样体积大的时候需要注意什么呀？

  这个好解决啊 要么用银染（分辨率比靠马斯亮蓝高10-100倍吧）
  要么蛋白样品用丙酮沉淀

• shkudo (2014-1-10 17:46:25)

  这个好解决啊 要么用银染（分辨率比靠马斯亮蓝高10-100倍吧）
  要么蛋白样品用丙酮沉淀
  
  =====================================================
  
  目前还不能用银染，关键是同样的方法也有做出来好的时候，如图二

• shkudo (2014-1-10 17:46:44)

  这个好解决啊 要么用银染（分辨率比靠马斯亮蓝高10-100倍吧）
  要么蛋白样品用丙酮沉淀
  
  ================================================
  
  目前还不能用银染，关键是同样的方法也有做出来好的时候

• shkudo (2014-1-10 17:47:06)

  我也出现过这种情况，不知道为甚末，有时候好，有时候不好，楼主，你的蛋白是每次电泳前先变性，还是先先把所有蛋白变性好，然后分装，每次电泳前使用啊，也就是说蛋白每次变性的条件一样吗，我怀疑是某一次变性不好，不知道是不是，交流啊

• 2541 (2014-1-10 17:47:30)

  35ul的上样量你是怎么上的？看你的胶好像也是0.75mm的10个上样孔的。这样的胶每次最多上样量是18ul左右。你是不是上完18ul后电泳一段时间，等样品都进入浓缩胶后再上样18ul?
  如果是这样，很可能是样品在浓缩胶中不能完全浓缩好成一条直线，造成在分离胶中分辨率低下。

• shkudo (2014-1-10 17:48:02)

  我也出现过这种情况，不知道为甚末，有时候好，有时候不好，楼主，你的蛋白是每次电泳前先变性，还是先先把所有蛋白变性好，然后分装，每次电泳前使用啊，也就是说蛋白每次变性的条件一样吗，我怀疑是某一次变性不好，不知道是不是，交流啊
  
  ====================================================================================================
  
  我的LOADING BUFFER 是配好的，每次上样前把样品与LOADING BUFFER 混合后，煮沸3-5分钟后上样，变性条件都一样的呀，好郁闷

• shkudo (2014-1-10 17:48:20)

  QUOTE:

  原帖由 2541 于 2014-1-10 17:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  35ul的上样量你是怎么上的？看你的胶好像也是0.75mm的10个上样孔的。这样的胶每次最多上样量是18ul左右。你是不是上完18ul后电泳一段时间，等样品都进入浓缩胶后再上样18ul?
  如果是这样，很可能是样品在浓缩胶中不能完全浓 ...

  我的胶是0.75mm的10个上样孔，上样槽上满的话是40ul，但上满的 话几乎没有跑好的时候，所以上35ul的，是一次性上样的。你 后面说的那 种方法我 还没用过，不 过我 会尝试一下。谢谢
  

• zsxan1990 (2014-1-10 17:48:46)

  总是觉得是上样量太大了的缘故。浓缩胶的不会很宽，加上一开始的电压不高，可能会造成蛋白不能全部压在一条线上再进分离胶吧~~~~ 交流交流......

• kuohao17 (2014-1-10 17:49:13)

  条件：浓缩胶80V,分离胶160V.
  蛋白样品浓度是0.25mg/ml,上样量35ul,
  结果:有时候跑成如图一的样子,也有跑的好的时候(图二)
  另外,同样的条件下,蛋白浓度若是1mg/ml,上样量10ul,条带从来都很正常的
  请教:条带跑成图一的样子是怎么引起的?
  谢谢！
  
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  这个主要是上样体积和浓缩胶的原因。
  1、上样体积大，就可能导致出现图一。
  2、浓缩胶过段也可以出现图一的问题。
  楼主可以通过调整浓缩胶的高度来调节，如若上样体积大就把浓缩胶配的长一点。
  另外，楼主跑胶电压有点稍大。分离胶建议120V一下，跑得慢一点可以好一点。

• shkudo (2014-1-10 17:49:37)

  QUOTE:

  原帖由 kuohao17 于 2014-1-10 17:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  条件：浓缩胶80V,分离胶160V.
  蛋白样品浓度是0.25mg/ml,上样量35ul,
  结果:有时候跑成如图一的样子,也有跑的好的时候(图二)
  另外,同样的条件下,蛋白浓度若是1mg/ml,上样量10ul,条带从来都很正常的
  请教:条带跑成图一的 ...

  可同样的条件也有跑出来好的时候，我有试过把浓缩胶加长，可效果不怎么明显，进入分离胶之前还是很粗的条带，前辈说的第二点我会尝试一下的，谢谢

• shkudo (2014-1-10 17:49:53)

  QUOTE:

  原帖由 zsxan1990 于 2014-1-10 17:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  总是觉得是上样量太大了的缘故。浓缩胶的不会很宽，加上一开始的电压不高，可能会造成蛋白不能全部压在一条线上再进分离胶吧~~~~ 交流交流......

  恩，是的，但是没办法，样品不能浓缩，只能加大上样量，不关2怎么弄，进入分离胶之前都是很粗的条带

• zsxan1990 (2014-1-10 17:50:20)

  QUOTE:

  原帖由 shkudo 于 2014-1-10 17:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  恩，是的，但是没办法，样品不能浓缩，只能加大上样量，不关2怎么弄，进入分离胶之前都是很粗的条带

  样品不能浓缩的话，还是把浓缩胶做长些，还有我觉得你浓缩胶的电压有点大的，试着把浓缩胶的电压降低到50-60V，尽量使样品在浓缩胶离跑慢些，待压成线之后再进入分离胶。

• kuohao17 (2014-1-10 17:50:39)

  
  那就只有再实际的试试了啊，分析再多不实践也不知分析的对不对，呵呵 继续关注，学习一下

• jrwyyplt (2014-1-10 17:50:58)

  这好像只是溴酚兰的效果，实际上蛋白条带还是好的

• jrwyyplt (2014-1-10 17:52:31)

  
  请问你用的是几乘的buffer，蛋白样品浓度是0.25mg/ml,用5xbuffer，上样量只须10ul，就可以很清楚看见蛋白条带的

• glass (2014-1-10 17:52:49)

  
  感觉，你跑的还好啊，出现那个情况，我感觉和胶，的密度不均匀有过，问是否你的胶有没有漏的情况，好像两边漏也出现这个样子

• kuaizige (2014-1-10 17:53:08)

  这是皱眉效应，电压的问题，小电压跑跑，浓缩胶50V，分离胶100V，还有假冰水浴降温看看。