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【求助】用MYD88转化DH5a

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-1-10 22:09    作者: bluelake    来源: 分析测试百科网

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【求助】用MYD88转化DH5a
我用2.5微升的myd88（滤纸上剪下的，忘记当时是否戴手套了，是否会有DNase影响，50微升TE离心，4度保存）转化OD600=0.42的DH5a，（100mmol的氯化钙制备感受态，4度12小时后用）用50微克/毫升Amp筛选，可做了几次都不成功，我郁闷死了。我第一次做这个，不知是那有问题，也不知实验的关键点和重点在那，希望师兄师姐指点一下迷津，感激不尽。
对了，请问有没有MYD88质粒的相关知识
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  • guagua (2014-1-10 22:10:40)


    重点可能在，是否已经把滤纸上质粒溶解下来，用适当体积的高压ddH2O或TE，我一般用50ul，取5ul转化。

  • bluelake (2014-1-10 22:10:59)

    感受态制备中氯化钙的浓度是否对转化影响很大，我制备的100mM的，称1.11g配成100ml。但我看别的说法是50mM的，称0.28g，两者的比值不对啊？怎么回事！

  • guagua (2014-1-10 22:11:36)

    我们也用0.1M cacl2,感受态问题不会很大，你同时带个阳性对照。

  • bluelake (2014-1-10 22:11:59)

    QUOTE:

    原帖由 guagua 于 2014-1-10 22:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    我们也用0.1M cacl2,感受态问题不会很大，你同时带个阳性对照。
    兄弟，别怪俺浅薄，阳性对照指什么？

  • guagua (2014-1-10 22:12:39)

    随便找个质粒转一下，严格应该是找个以前你要来的，从滤纸上溶下来的质粒。以此确定你的感受态，转化过程是否存在问题。如果对照长得很好，你目的质粒没有长克隆，那再怀疑其他的问题。

  • bluelake (2014-1-10 22:13:46)

    我试过了，一样的没结果。我问了一个老师，他说可能是我的感受态制备有问题，（他比较忙也没多说）所以我想是不是我的细节没处理好，1制感受态时，离心后用pep吹打混匀时有点剧烈，2转化时，加过质粒混匀时，拍的问题？
    兄弟，这种小实验是否都相当成熟了，都没人聊这个了。谢谢您对我的帮助！

  • guagua (2014-1-10 22:15:50)

    你试一下用RbCl2方法作的感受态，就是试剂有点贵。
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