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【求助】Western blot
各位大侠：【求助】Western blot
最近做了好一阵子Western blot，但Marker的问题一直没解决，希望大侠们指点迷津。
我用的电泳缓冲液系统是Tris-glycin,分离胶浓度是7.5%(SDS-PAGE)，电泳槽是Bio-rad protean tetra cell,目的蛋白的分子量是250kD和6kD，Marker是Ivitrogen Novex® Sharp Pre-stained Protein Standard(3.5kD-260KD)，转膜条件是电压100V，100分钟。
电泳时发现，随着时间延长，各条带渐由锐利变模糊，且30kD以下的marker条带始终不能有效地分开；其次，转膜前，胶上的彩色marker是可以看见的，并可分辨出大部分的条带，但是转膜后，Marker不知所踪了。虽然最后显色后有阳性目的条带，但老板说必须把Marker转出来，否则不好比较目的蛋白的表观分子量。于是试了好几次，包括减少转膜时间100V，75分钟，后改为电压80V,75分钟，再后来减少转膜时间(30分钟，100V)，但问题始终一样：目的条带清晰，而Marker没有。
请各位大侠，请伸出摇手，给小生一条明路!
另外，想问一下，在恒压湿转时，同时转一块胶与同时转两块胶时的电阻是不是不一样，因而电流也不一样，转膜条件是不是也要相应的改变？
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最新回复
lyxsqs (2014-1-10 22:18:35)
我用的膜是Millipore 0.45um PVDF膜
+小生怕怕+ (2014-1-10 22:19:12)
1.不知道你marker的上样量是多少？如果很少的话，特别是小分子量的marker很容易就转不见，这个是我的亲身体会，可以加大上样量试试，或许有用。
2.还有你转小分子量的时候用的PVDF膜是0.45um的话，小分子量的marker会不会转过的问题，也是值得探讨，是不是可以考虑0.22um的膜。
3.胶的浓度问题，你的目的是6kda和250kda的话，不知道你是不是在同一块胶上跑的电泳，如果是，建议你用不同浓度的胶分开跑电泳，不同浓度的胶的最佳分离范围是不同的，低浓度的胶跑小分子量蛋白的话很容易扩散，包括marker。高浓度的胶，大分子蛋白分不开，电泳时间过长。
4.在恒压湿转时，同时转一块胶与同时转两块胶时的电阻是不是不一样，因而电流也不一样，转膜条件是不是也要相应的改变？
这个问题我也同时转过两块膜的，分子量不同，分放到两个夹子里面转的，横流转的，转膜的条件本人觉得没有多少变化（横流下）。也是遵循250mA分子量多大（40-100kda）就转多长时间，时间爱你到了把小的转膜的夹子拿出来，大分子量的转膜夹子继续转。小分子量（几个kda的）不知道如何来调整时间，大分子量的可以适当延长时间，转膜效果可以。
个人愚见，希望对你有所帮助！
guagua (2014-1-10 22:19:40)
分离胶浓度是7.5%，30kD以下的marker条带始终不能有效地分开。这种现象是正常的，分离胶浓度越低，小分子量越跑步出来。至于是跑出去还是积聚在溴酚蓝的地方就不清楚了。
vvmmoy (2014-1-10 22:20:07)
如要求小的蛋白条带清楚，建议使用4－20％的梯度胶。另外既然做western的话，现在没有必要使用pre-stained marker了。可以使用western blot makrer结果很漂亮
lyxsqs (2014-1-10 22:21:09)
各位大侠，你们好!
这是我做的目的蛋白条带，右边是非还原，左边是还原的，但PVDF膜上就是没有预染彩虹Marker
14462091.snap.jpg
lyxsqs (2014-1-10 22:21:34)
另外，我想单就转膜缓冲液而言，SDS、甲醇和甘氨酸对转膜效率各有什么影响？还有，转膜缓冲液中，甘氨酸的配方有两种，一种是14.4，还有一种好像是18.x的，各适用于什么条件？
guagua (2014-1-10 22:22:03)
转膜条件80V，电泳140mA，30分钟
这个是恒压还是恒流，是干转还是湿转啊？
我的电转缓冲液的配方放在实验室没有拿回，改天会告诉你我的配方。
hustwb (2014-1-10 22:22:33)
有可能彩虹marker修饰不够完全，加电压后染料与蛋白分离，所以看不到染料了。
lyxsqs (2014-1-10 22:23:00)
是湿转，恒压80V，30分钟
tudou85 (2014-1-10 22:24:00)
1， 30kD以下的marker条带始终不能有效地分开，是不是分离胶的浓度太低了，用15%的分离胶效果应该会好点，大分子量区的蛋白应该也能分开
2，转膜后，Marker不知所踪了，加大Marker的上样量看看
lyxsqs (2014-1-10 22:24:20)
前两天，换了PVDF膜，同样是0.45um的，同样的彩虹Marker，这次转上了，我想haigene说的的情况可能性比较大，就是加电压后，蛋白与染料分离了，终于找到原因了。
谢谢各位大虾!!
lyxsqs (2014-1-10 22:24:44)
2541 (2014-1-10 22:25:02)
fqswdzd (2014-1-10 22:25:28)
你好楼主，祝贺你找到原因了，但是我对你的实验还有很多疑虑，不知道能不能看看你的实验结果
lyxsqs (2014-1-10 22:25:53)
PVDF膜事先要用甲醇激活一下。另外，相差这么大的两个蛋白肯定不能再一块胶上跑了。小蛋白还是浓度大点的胶才行。。。
911 (2014-1-10 22:26:22)
1 Marker 上样量 少
2 我用的是恒流的80mA
3 最有可能 是你在洗膜的时候把MARKER洗掉了，我就是遇到这样情况，转膜后看的很清楚，但是等到显色之后就看不清楚了
youyou99 (2014-1-10 22:27:18)
最近做了好一阵子Western blot，但Marker的问题一直没解决，希望大侠们指点迷津。
我用的电泳缓冲液系统是Tris-glycin,分离胶浓度是7.5%(SDS-PAGE)，电泳槽是Bio-rad protean tetra cell,目的蛋白的分子量是250kD和6kD，Marker是Ivitrogen Novex® Sharp Pre-stained Protein Standard(3.5kD-260KD)，转膜条件是电压100V，100分钟。
电泳时发现，随着时间延长，各条带渐由锐利变模糊，且30kD以下的marker条带始终不能有效地分开；其次，转膜前，胶上的彩色marker是可以看见的，并可分辨出大部分的条带，但是转膜后，Marker不知所踪了。虽然最后显色后有阳性目的条带，但老板说必须把Marker转出来，否则不好比较目的蛋白的表观分子量。于是试了好几次，包括减少转膜时间100V，75分钟，后改为电压80V,75分钟，再后来减少转膜时间(30分钟，100V)，但问题始终一样：目的条带清晰，而Marker没有。
请各位大侠，请伸出摇手，给小生一条明路!
另外，想问一下，在恒压湿转时，同时转一块胶与同时转两块胶时的电阻是不是不一样，因而电流也不一样，转膜条件是不是也要相应的改变？
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我用的也是这个仪器，我是摸索转膜条件好久了，我做的是160KDa大小的分子，没孔上样量在35微克左右。试过2小时到4小时的转膜时间，条件是（恒流0.35A，NC膜)目的蛋白始终过不去，最后是加时间到了6小时，甚至8小时。目的蛋白终于做出来了，很亮和内参一样。但是有几个问题我不明白。1.转膜6小时和8小时后，用考吗思量蓝染胶后发现胶上仍有较多蛋白没转过，以43kDa（内参处）明显。为什么？2，都说小分子量蛋白时间长会转过头，同一个胶，转了8小时后，43kDa和32kDa大小的蛋白都能做出来，并且条带非常清楚，这是怎么回事。你说这里有没有蛋白转过头而丢失了呢？
youyou99 (2014-1-10 22:28:03)
mickeylin (2014-1-10 22:28:36)
QUOTE:
并不是进口的试剂就好。很显然你的发光液发光时间太短了。建议更换发光液。另外：发光前膜最好用PBS洗涤一次，并尽量移除多于的PBS，这样发光效果比较好。
31732873.jpg
youyou99 (2014-1-10 22:29:02)
QUOTE:
请教下，现在有哪几种较好的发光显影液呢？【求助】Western blot