【求助】关于Superdex 75的使用

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• shenkunjie (2014-1-14 10:40:56)

  superdex 75是GE目前分辨率和选择性最高的凝胶过滤介质，高流速，低反压。有预装柱和层析介质卖，如果你买层析介质，可手工装柱。
  如果你装柱技术高的话，做纯化建议自己装，预装柱非常昂贵。如果做HPLC分析，最好买预装柱，分辨率高

• gmjghh (2014-1-14 10:42:35)

  您好！感谢您的帮助。可否再介绍一下使用方法。在纯化时是否一定要使用恒流泵？应该使用哪种流动相呢？谢谢！

• JK.jon (2014-1-14 10:42:55)

  不知道的纯化的目的是什么，有哪些设备可以使用。分子筛层析比一般的层析操作要求要高一些，不仅在操作人员的熟练程度上（装柱、上样），还在对设备的要求上（流速稳定、压力稳定，柱的均匀性好）。如果你是一个纯化新手，而且没有好的设备，只有衡流泵的话，还是先想想别的纯化方案，实在不行再来试分子筛。
  流动相没有很特别的要求，常规的缓冲液都能使用，推荐PBS体系。
  superdex 75不能用于HPLC系统，它的基质还是凝胶，耐压性不够，而且HPLC所用的都是预装柱。

• gmjghh (2014-1-14 10:43:31)

  我在原核表达一种蛋白，有两种形式，所以想使用Superdex 75将其分开。在SDS-PAGE中已看到有两条带，分子量相差不大。所查阅的文献中也表明可以使用Superdex 75将两者分开。我们实验室只有一台HPLC，没有其他相关设备。所以我想是否可以使用HPLC分离。请问，如果不使用分子筛，还可以使用哪些分离方法呢？我主要是想证明一下，这种原核表达蛋白是由两种成份组成，并且两者间的相对含量，以及获得一些纯品，用于CD及质谱分析。谢谢了，请各位多指教！

• JK.jon (2014-1-14 10:43:58)

  QUOTE:

  原帖由 gmjghh 于 2014-1-14 10:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我在原核表达一种蛋白，有两种形式，所以想使用Superdex 75将其分开。在SDS-PAGE中已看到有两条带，分子量相差不大。所查阅的文献中也表明可以使用Superdex 75将两者分开。我们实验室只有一台HPLC，没有其他相关设备。所以我 ...

  1、Superdex 75分子筛纯化两种蛋白的分子量相差至少2-3倍，所以你的蛋白应该无法用Superdex 75进行分离纯化。
  2、用于质谱分析的蛋白量要到mg级，用分析型的HPLC无法纯化得到如此量的蛋白。
  3、同一个原核菌株表达的蛋白如果有两种分子量不同的成分，可能原因一是表达提前终止，二是降解，三是结构差异。这些对纯化来说都是很困难的事，因为它们的性质相差很小。
  4、“证明这种原核表达蛋白是由两种成份组成”有何意义？证明你构建的菌株不好还是证明你的表达产物会降解？原核表达蛋白的不均一本身就是不对的，应该想办法去改正。
  5、如果SDS-PAGE中的两条带很接近，而且量上也不像是降解产物的话，也许和电泳条件有关。
  6、纯化方法有多种，最常用的是离子交换、亲和、疏水、反相、沉淀等，我对你的原料一无所知，无从谈起怎么去纯化。

• gmjghh (2014-1-14 10:44:41)

  
  两种蛋白是结构差异，但其分子量不知道是否有2－3倍。请问如果要使用质谱和CD分析所表达的蛋白，必须是可溶性吗？包涵体可以直接用于分析吗？

• kuohao17 (2014-1-14 10:45:07)

  
  Superdex 75 HR 1.0x30预装柱子如果你的机器能连上的话,那是可以用的,而且它的填料平均粒径13微米,分辨率远高于普通的Superdex填料,它的平均粒径为34微米,我们以前实验室的waters HPLC用的是Superdex 75 HR 1.0x30预装柱,所以没问题.此外我觉得你可选择HPLC的凝胶过滤柱,通常是0.75x30如TSK-GEL G系列，选择合适的分离范围，６微米的填料分辨率又高于Superdex 75 HR 1.0x30.多上几次样即可.你也可选择HPLC离子柱.这些柱子都不算便宜,我觉得还是TSK-GEL G系列更好用.Superdex 75及琼脂糖凝胶填料都可用在HPLC设备上,因为这些填料颗粒大,而且柱子都粗,压力不大,完全没问题,关键是需要有接口,别漏就可以,我见过一些用1毫升的镍柱在HPLC上用的.都没问题.但是HPLC都是金属管道,而且细,容易高盐腐蚀或堵或一些金属离子导致蛋白失活,所以用的少,我说的那waters HPLC用的是塑料管道的.大多做蛋白的都用的是塑料管道.如果你蛋白不是可溶性的,那通常不能选择凝胶柱.

• gmjghh (2014-1-14 10:45:32)

  
  感谢各位专家给予的解答，小弟刚做蛋白纯化不久，很多东西还是一无所知。请问关于蛋白纯化及功能分析方面是否有一些比较经典的书，就像分子生物学中的分子克隆一样的参考书。同时我还想问一下，如果后续实验要对所表达的蛋白进行质谱分析和圆二色谱分析其结构，那所表达的蛋白一定要是可溶性的吗？包涵体可否直接用于质谱和圆二色谱分析？有些问题可能问得有些无知，请各位见谅了！