【求助】为什么我的内参actin每次都只出三个孔,不能全出?

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-1-14 16:38 作者: remenb 来源: 分析测试百科网

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【求助】为什么我的内参actin每次都只出三个孔,不能全出?

做actin做了可能有10次左右了，只有一次出了8个孔，第9孔没出（第10个孔是maker，剪膜的时候剪掉没有要），剩下的几次要不是actin完全不出，要不就是只出3个孔。但是大部分情况下与一起做的目的蛋白却能出。
我很迷惑。不知道是不是曝光的时候出了问题。因为我新换了一只一抗来做也是这样。

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remenb (2014-1-14 16:38:40)

这是做出了8条带的那次的图

52821456.jpg
remenb (2014-1-14 16:39:24)

这是其中一次只出了三条带的，曝光了10min。总蛋白上样量为102ug。

79341700.jpg
ladyhuahua (2014-1-14 16:39:52)

我前几天做的也是这样，内参GAPDH只出来几个孔，但目的蛋白全出来了。
我觉得很疑惑，把膜晾干重激活后再孵新的GAPDH，结果全出来了。
remenb (2014-1-14 16:40:29)

我有一次重孵过，还是没出。
不过打算下次再试一试。
不知道是什么原因造成的
nvdabing (2014-1-14 16:41:38)

我的内参也总是有问题，不是多条带就是前面一半的内参出不来。真火
remenb (2014-1-14 16:43:27)

今天我又做了一次，一抗和二抗浓度都加大了，还是只出了最后三个孔。。。。。
郁闷啊
yjf1026 (2014-1-14 16:48:44)

减少上样量试试，有一次我的GAPDH也是莫名其妙的中间少了两个，减少上样量效果好多了。理论说不清。知道的战友解释一下。
你可以不做MARKER，跑十个孔试试效果，你的目的蛋白的迁移率你应该也摸的差不多了，就不用上M了。
am10 (2014-1-14 16:49:11)

回答你问题之前，我要先问清楚，1.你的蛋白浓度实在做western多久前测的2.你的上样计算确实没有问题么？一定要请同学再帮你大概看一看3.你只出三个孔actin的蛋白是不是一直就是这一组蛋白，如果是，那更要怀疑我给你提出的前两个问题了。回答我之后我再给你分析。
fox_79 (2014-1-14 16:49:33)

QUOTE:
原帖由 am10 于 2014-1-14 16:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

回答你问题之前，我要先问清楚，1.你的蛋白浓度实在做western多久前测的2.你的上样计算确实没有问题么？一定要请同学再帮你大概看一看3.你只出三个孔actin的蛋白是不是一直就是这一组蛋白，如果是，那更要怀疑我给你提出的前 ...
我也有这个问题，western一般在蛋白提出多久内做比较好一点。我的蛋白反复用几次后actin也是跑不出来，gapdh也是非常淡。
am10 (2014-1-14 16:50:00)

QUOTE:
原帖由 fox_79 于 2014-1-14 16:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

我也有这个问题，western一般在蛋白提出多久内做比较好一点。我的蛋白反复用几次后actin也是跑不出来，gapdh也是非常淡。
不是样品有问题就可能是抗体有问题
我做过冻融实验，10次以内不会明显影响actin与GAPDH