【求助】蛋白表达

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-1-15 23:44 作者: 奇蒙kate 来源: 分析测试百科网

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【求助】蛋白表达

我在做原核表达，表达出来的蛋白除了目的带之外，还有两条杂带略小于我的目的带，怎么都纯化不出来。用Western Blot验证那两条杂带既不带有His标签，也不是大肠杆菌自身的蛋白。请各位专家帮忙分析下该杂带是否是丢失了His标签的目的蛋白，或者是其他东西。

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最新回复

ztonyc (2014-1-15 23:45:20)

很可能是目的蛋白质的降解条带。我们以前做过的一个蛋白质不带标签，纯化后目的蛋白质下方总有两条杂带，最初怀疑降解条带做过一次WB，没有测到。然后花了一个月时间尝试各种方法去除杂带，效果不佳，再做WB确证是目的蛋白质降解条带。
奇蒙kate (2014-1-15 23:45:44)

QUOTE:
原帖由 ztonyc 于 2014-1-15 23:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
很可能是目的蛋白质的降解条带。我们以前做过的一个蛋白质不带标签，纯化后目的蛋白质下方总有两条杂带，最初怀疑降解条带做过一次WB，没有测到。然后花了一个月时间尝试各种方法去除杂带，效果不佳，再做WB确证是目的蛋白质降 ...
首先感谢您的回复。
请问你的蛋白没有标签，是怎么WB确证是目的蛋白降解条带的？难道你的蛋白上面还有什么特异性的区域？谢谢！
gogo (2014-1-15 23:46:03)

我在做我在做原核表达，表达载体经测序鉴定完全正确，可表达条带明显比目的条带小，ei差不多小一倍，也没有密码子提前终止，请各位专家帮忙分析下这是什么原因，实验都不知该如何下手了
奇蒙kate (2014-1-15 23:46:36)

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=8262910&sty=2')
到这里看看有没有你想要的，对你的问题，我也不懂为什么。
nikun230 (2014-1-15 23:46:53)

你怎么用western知道不是大肠杆菌自身的带？
His tag是在N端，C端还是中间？His tag的western本身有问题吗？
是不是目的带纯化不出来？那么western确定那是你的目的带了吗？
纯化不出来是什么意思？是不是不可溶？是不是可溶而不bind柱子？是不是bind柱子但很容易被洗脱？是不是很不稳定很快被降解？要用SDS-PAGE 追踪每一步，这样才能对症下药。
提醒guiyl不要四处打广告。
ztonyc (2014-1-15 23:47:25)

首先感谢您的回复。
请问你的蛋白没有标签，是怎么WB确证是目的蛋白降解条带的？难道你的蛋白上面还有什么特异性的区域？谢谢！

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我的目的蛋白质有抗体，第一次做WB时可能是技术原因没能检测到，后来再做就能检测到降解条带。
奇蒙kate (2014-1-15 23:48:10)

你怎么用western知道不是大肠杆菌自身的带？
His tag是在N端，C端还是中间？His tag的western本身有问题吗？
是不是目的带纯化不出来？那么western确定那是你的目的带了吗？
纯化不出来是什么意思？是不是不可溶？是不是可溶而不bind柱子？是不是bind柱子但很容易被洗脱？是不是很不稳定很快被降解？要用SDS-PAGE 追踪每一步，这样才能对症下药。
提醒guiyl不要四处打广告。

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我用了大肠杆菌阳性血清做了WB，没有条带。阳性对照有条带。
His tag在N端，WB本身我自认为是没问题的，因为这个实验我重复了四次。
纯化不出来是指那两条杂带去不掉，和我的目的带分子量太接近了。

74863676.jpg
奇蒙kate (2014-1-15 23:48:30)

我的目的蛋白质有抗体，第一次做WB时可能是技术原因没能检测到，后来再做就能检测到降解条带。

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哦，谢谢你，尽管我已经做了四次了，但是我决定在做一次。呵呵……
非常感谢！
ztonyc (2014-1-15 23:49:11)

我用了大肠杆菌阳性血清做了WB，没有条带。阳性对照有条带。
His tag在N端，WB本身我自认为是没问题的，因为这个实验我重复了四次。
纯化不出来是指那两条杂带去不掉，和我的目的带分子量太接近了。

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你的目的是做什么，从电泳上看纯度已经大于90%，如果只是常规测活或者做抗体纯度已经足够。另外如果目的蛋白质没有抗体，个人感觉再做WB可能意义不大了。
奇蒙kate (2014-1-15 23:49:45)

QUOTE:
原帖由 ztonyc 于 2014-1-15 23:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
我用了大肠杆菌阳性血清做了WB，没有条带。阳性对照有条带。
His tag在N端，WB本身我自认为是没问题的，因为这个实验我重复了四次。
纯化不出来是指那两条杂带去不掉，和我的目的带分子量太接近了。

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谢谢您的回复。
我只是觉得多了两条杂带，看着不舒服，而且害怕这两条杂带会对以后抗体检测结果有影响。
gogo (2014-1-15 23:50:05)

我在做我在做原核表达，表达载体经测序鉴定完全正确，可表达条带明显比目的条带小，ei差不多小一倍，也没有密码子提前终止，请各位专家帮忙分析下这是什么原因，实验都不知该如何下手了
HP007 (2014-1-15 23:50:29)

降解一点了吧
了了 (2014-1-15 23:50:47)

我也觉得纯度很高了。看你目的是什么了。