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【求助】蛋白表达及纯化
【求助】蛋白表达及纯化
我在做原核表达，表达出来的蛋白除了目的带之外，还有两条杂带略小于我的目的带，怎么都纯化不出来。用Western Blot验证那两条杂带既不带有His标签，也不是大肠杆菌自身的蛋白。请各位专家帮忙分析下该杂带是否是丢失了His标签的目的蛋白，或者是其他东西。
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【求助】蛋白表达及纯化
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-1-16 15:34 作者: mysmdbl 来源: 分析测试百科网
最新回复
yonger (2014-1-16 15:35:27)
很可能是目的蛋白质的降解条带。我们以前做过的一个蛋白质不带标签，纯化后目的蛋白质下方总有两条杂带，最初怀疑降解条带做过一次WB，没有测到。然后花了一个月时间尝试各种方法去除杂带，效果不佳，再做WB确证是目的蛋白质降解条带。
mysmdbl (2014-1-16 15:38:01)
QUOTE:
首先感谢您的回复。请问你的蛋白没有标签，是怎么WB确证是目的蛋白降解条带的？难道你的蛋白上面还有什么特异性的区域？谢谢！
gogo (2014-1-16 15:38:21)
我在做我在做原核表达，表达载体经测序鉴定完全正确，可表达条带明显比目的条带小，ei差不多小一倍，也没有密码子提前终止，请各位专家帮忙分析下这是什么原因，实验都不知该如何下手了
mysmdbl (2014-1-16 15:40:01)
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=8262910&sty=2')
到这里看看有没有你想要的，对你的问题，我也不懂为什么。
u234 (2014-1-16 15:40:26)
你怎么用western知道不是大肠杆菌自身的带？
His tag是在N端，C端还是中间？His tag的western本身有问题吗？
是不是目的带纯化不出来？那么western确定那是你的目的带了吗？
纯化不出来是什么意思？是不是不可溶？是不是可溶而不bind柱子？是不是bind柱子但很容易被洗脱？是不是很不稳定很快被降解？要用SDS-PAGE 追踪每一步，这样才能对症下药。
avi317 (2014-1-16 15:40:59)
请问你的蛋白没有标签，是怎么WB确证是目的蛋白降解条带的？难道你的蛋白上面还有什么特异性的区域？谢谢！
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我的目的蛋白质有抗体，第一次做WB时可能是技术原因没能检测到，后来再做就能检测到降解条带。
avi317 (2014-1-16 15:51:22)
QUOTE:
我用了大肠杆菌阳性血清做了WB，没有条带。阳性对照有条带。His tag在N端，WB本身我自认为是没问题的，因为这个实验我重复了四次。
纯化不出来是指那两条杂带去不掉，和我的目的带分子量太接近了。
74863676.jpg
mysmdbl (2014-1-16 15:52:51)
QUOTE:
哦 ，谢谢你 ，尽管我已经做了四次了，但是我决定在做一次。呵呵……非常感谢！
zsxan1990 (2014-1-16 15:55:36)
His tag在N端，WB本身我自认为是没问题的，因为这个实验我重复了四次。
纯化不出来是指那两条杂带去不掉，和我的目的带分子量太接近了。
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你的目的是做什么，从电泳上看纯度已经大于90%，如果只是常规测活或者做抗体纯度已经足够。另外如果目的蛋白质没有抗体，个人感觉再做WB可能意义不大了。
mysmdbl (2014-1-16 16:01:05)
QUOTE:
谢谢您的回复。我只是觉得多了两条杂带，看着不舒服，而且害怕这两条杂带会对以后抗体检测结果有影响。
gogo (2014-1-16 16:01:22)
我在做我在做原核表达，表达载体经测序鉴定完全正确，可表达条带明显比目的条带小，ei差不多小一倍，也没有密码子提前终止，请各位专家帮忙分析下这是什么原因，实验都不知该如何下手了
hold住 (2014-1-16 16:05:06)
降解一点了吧
utt0989 (2014-1-16 16:05:56)
我也觉得纯度很高了。看你目的是什么了。
【求助】蛋白表达及纯化