【求助】SDS-PAGE电泳发生蛋白降解？

最新回复

• yjf1026 (2014-1-16 16:08:45)

  
  估计你用来调PH值的酸碱液太强了，是不是用HCl或NaoH？蛋白样品一般不能用强酸强碱调pH值，虽然最终的pH差异才0.1，但在强酸碱液滴入样品中时，会导致局部pH剧烈变化，很容易导致蛋白降解或变性沉淀。蛋白样品调pH值可以用浓缓冲液。比如要调高，可用1M 的Tris-Hcl，pH 9.0。

• 00无名指00 (2014-1-16 16:10:52)

  但是我这个现象应该不是强酸碱引起的，因为我调低pH的那个样品很好，而未经调pH的却发生严重降解！！！
  希望高手们继续解答

• ending (2014-1-16 16:17:19)

  
  还要调PH值啊？怪不得我的样品是小蛋白，放四度 没两三天就严重降解，同样的东西隔天再上样，降解的都快看不见了。

• 8princess8 (2014-1-16 16:17:45)

  
  如果是没有调PH的降解，那有可能是原缓冲系统不利于蛋白的保存，或者原BUFFER里蛋白酶的作用，仔细查找，一定有原因，希望能有帮助

• kuohao17 (2014-1-16 16:18:04)

  
  在含有SDS的条件下蛋白酶很难有活性，化学降解可能性确实存在，但不高（强酸强碱条件下可能性大点，但在上样缓冲液的条件下可能性很小）。我认为更可能是由于没有沸煮，在不同pH条件下二硫键被还原的程度不同，而出现不同的带。

• yonger (2014-1-16 16:18:33)

  
  嗯，楼上考虑的比我细致，有这种可能。期待楼主验证后给出答案。

• 00无名指00 (2014-1-16 16:19:01)

  在含有SDS的条件下蛋白酶很难有活性，化学降解可能性确实存在，但不高（强酸强碱条件下可能性大点，但在上样缓冲液的条件下可能性很小）。我认为更可能是由于没有沸煮，在不同pH条件下二硫键被还原的程度不同，而出现不同的带。
  
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  我今天对比了一下，煮沸后效果有所改善，pH6.0样品主带有所增加，下面的模糊一片的疑似降解带也少了很多，但与pH5.0的样品比较，主带还是偏少。
  这说明主要原因还是没找到，继续征求中。。。。。

• 00无名指00 (2014-1-16 16:19:46)

  
  将样品调至pH5.5进一步比对，发现煮后主带明显增加，比pH6.0效果好很多，但还是没有达到pH5.0的程度。这些对比实验说明上样pH对蛋白电泳影响很大，应该不是电泳降解的原因。或许是不同的pH条件结合SDS量不同所致；或者是蛋白出现糖基化，影响电泳结果，大家认为如何？
  1-2为pH5.0和pH5.5不煮的样品；3-4为pH5.0和pH5.5煮的样品；
  5-6为pH5.0和6.0煮的样品，用来对比楼主的。

• xingyi08 (2014-1-16 16:20:06)

  
  应该不是PH的原因，，我也出现过这样的情况
  简单描述：我的蛋白缓冲是PH8.5，以前生产出来的蛋白，重来没有出现过问题，但是现在我的样品，在同一块凝胶上，不同的梳空不同上样量，有的蛋白很正常，有的就像你的图片中的那种“降解”，我前后重复了5次电泳，也重复不上，好像“降解”很随机。
  4度电泳也试过还是不行。
  前提：所有的电泳试剂都来源与一样的批号，以前生产的除外。。。。。
  郁闷中～～～～～～～

• 00无名指00 (2014-1-16 16:20:25)

  
  应该是pH不同所致还原程度不一致造成的，我把各样品都煮沸3分钟后上样，双带现象就没有了。要是你的蛋白耐热，你也可以煮沸上样试试！

• hold住 (2014-1-16 16:20:47)

  上样液PH调一下吧

• 7437654 (2014-1-16 16:21:27)

  
  原因有两个,1.样品没100度煮两分钟,这样导致没彻底变性,结合SDS不完全,所以位置不一致.同时煮后可使蛋白酶失活.避免样品降解.2.同样道理,pH不合适.偏酸,导致SDS难解离彻底或导致蛋白不是完全带负性电荷,这个因素也不能忽略,主要是第一个原因.因此第二图很明显,煮后就基本一样.SDS-PAGE关键是蛋白要彻底变性,完全结合SDS,这样蛋白电泳时候才能完全按分子量大小拍布.