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【求助】Ni-NTA纯化His标签蛋白的洗脱方法有哪些？

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-1-16 20:05    作者: bgf5    来源: 分析测试百科网

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【求助】Ni-NTA纯化His标签蛋白的洗脱方法有哪些？

目前手上有一个别人构建的重组蛋白，含六个HIS标签，用QIAGEN公司的Ni-NTA supper flow纯化。
以前用《A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins》里面提供的方法，用lysis buffer重悬菌体，破碎，离心，上样，然后用Wash Buffer梯度洗杂蛋白，Elution buffer洗脱收集目的蛋白。
由于要用该蛋白上细胞，而不能确定用PBS透析就能完全除去咪唑
想请教各位，除了利用咪唑竞争洗脱之外，还有没有其他方法洗脱蛋白？Blush
谢谢~~~~
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最新回复

  • ALALA (2014-1-16 20:06:01)


    改变pH,或用EDTA直接螯合

  • bgf5 (2014-1-16 20:06:20)

    谢谢楼上
    改变PH可行，但是用EDTA会不会对填料有损伤呢？
    我的填料是反复用的

  • hustwb (2014-1-16 20:07:44)

    用低PH洗脱，NI离子也有不同程度的脱落
    用EDTA洗脱的原理就是把NI离子洗脱下来，同时把NI离子上面结合的6-HIS蛋白也洗下来
    这2种方法洗脱后的柱子都需要重新螯合NI离子，才能恢复柱子的载量

  • kuaizige (2014-1-16 20:08:03)


    可以试一下PH剃度洗脱然后再用米坐洗~~这样纯度非常的好~~

  • glass (2014-1-16 20:08:21)


    用低pH洗脱试一下，用低pH洗脱的填料可以使用十次之后再用EDTA脱Ni挂NI再生；如果用EDTA洗脱则要每次都需要挂NI再生。

  • kuaizige (2014-1-16 20:08:46)

    填料装好用过两次之后滴的很慢，而且里面有气泡，怎么处理以下呢？

  • lorri (2014-1-16 20:09:27)

    最好再生一下

  • bgf5 (2014-1-16 20:10:01)

    填料装好用过两次之后滴的很慢，而且里面有气泡，怎么处理以下呢？

    ===========================================================================================

    为了填料和蛋白的充分结合，在装柱时是不能有气泡的
    你用过两次之后滴得很慢，可能是因为你超声破碎后，上柱前没有用滤膜过滤，这样你的超声细胞碎片把柱子堵住了
    或者你的wash buffer里面有杂质，没有过滤，也可以把柱子堵住
    可以先把柱子再生一下，让盐酸胍作用久一点
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