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【求助】用于纯化的蛋白表达情况分析
【求助】用于纯化的蛋白表达情况分析
为了将含有组氨酸标签的蛋白质通过Ni离子层析柱纯化，并将获得的目的蛋白制成抗体。我先用溶菌酶破细胞4摄氏度过夜；第二天用220W的超声波处理（为了打碎核酸以防堵柱子）；收集一管后用12000r离心，获得沉淀，沉淀用Bing Buffer悬浮。分别将未离心前、离心后的上清、离心后的沉淀，用SDS-PAGE检测，观察到上清中没有目的条带，而沉淀和未离心前的液体中的目的蛋白深浅很一致，想请教各位这样是否说明我的目的蛋白是以包涵体的形式表达的？可是之前师姐的论文中分析结果是可溶性表达，是否是超声波会有影响？
很着急，谢谢各位了！
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最新回复
vivian4123 (2014-1-18 15:48:53)
上清体积是多少，有没有过分稀释以致电泳表达条带不清楚，如果排除这个可能，再按包涵体的处理方法对沉淀进行处理，用一些表面活性剂清洗掉细胞碎片，离心（包涵体密度大于细胞），如果沉淀中电泳检测还有很粗的条带，基本可以认为是包涵体。
vivian4123 (2014-1-18 15:49:09)
在很多情况下包涵体和可溶蛋白可能同时存在
gemei0115 (2014-1-18 15:49:25)
谢谢楼上，超声后的上清液的体积有8ml，共溶解25ml菌液的蛋白，这样的浓度可以吗？
remonte (2014-1-18 15:50:47)
如果之前有人证实是在上清里，你的上清没有目标条带而沉淀有，很可能是你诱导的时候浓度过高，蛋白以包涵体的形式存在了。这样的话你可以用函6M尿素的bingding buffer 去溶解沉淀，4°C过夜，离心后除去不溶物再过柱子。
fsdd817 (2014-1-18 15:51:14)
很可能是以包涵体的形式存在了，你可以改变诱导条件，降低诱导剂的浓度，降低诱导时间可以有所改善，如果你想直接免疫也可以，把包涵体纯化出来乳化后直接去免疫，可以产生针对一级结构的抗体。
gemei0115 (2014-1-18 15:51:39)
这两天我将蛋白处理过后跑SDS-PAGE发现，确实是以包涵体的形式表达了，并用8M尿素溶解了蛋白。
另外，由于我想用制备出来的抗体做WESTERN，一级结构的抗体可以用来进行试验吗？
yjf1026 (2014-1-18 15:52:11)
1、由于你的超声体积很小（8ml），超声时有没有充分冰水浴？，超声发热有可能使得目标蛋白变性沉淀。
2、“一级结构的抗体”表述方法有问题，难道你将抗体还原变性了？那么这样的抗体肯定是没有活性的。
3、你要说的是不是拿制备的抗体与一级结构的抗原蛋白做WB？
制备的抗体如果是多抗，一般问题不大，可以做wb。如果是单抗，那就不一定了。构象型的单抗很可能做不出WB，或反应很弱。做ELISA应该可以。
gemei0115 (2014-1-18 15:53:58)
应该有充分冰水浴。
请问如果想制得可以用于WB的多抗，通过ni柱纯化用8M尿素变性的包涵体后，将其乳化免疫实验动物，所产生的抗体可以用于WB吗？谢谢了
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