【求助】250KD蛋白WB问题

最新回复

• ritou1985 (2014-1-19 10:48:50)

  不能照说明书推荐的稀释度来稀释，你得自己摸摸条件。带粗了，你就再稀释一抗，二抗的浓度。1：2000不行，就3000，4000.

• 分子式 (2014-1-19 10:49:16)

  大分子量的western blot相对难做一些，首先你的分离胶浓度5%或者6%就可以了，转膜的时间要久一些，转移的时间可以适当的延长到90-120min；封闭的时间要长，如果是用5%脱脂牛奶封闭的话，可以提高牛奶的浓度，但是不能太高，太高的话会把结合位点全部封闭，你需要自己摸索一下，我自己觉得7%-8%还可以，你可以试一下；同时要降低一抗的浓度，你可以摸索一下以抗的浓度，做个梯度是最好的，如果觉得麻烦的话，可以先直接稀释到1：1万；二抗的浓度有时候影响不是很大，如果背景很高的话，你可以适当的降低二抗的浓度；加入ECL后如果很亮，曝光时间尽量短，显影要快，一旦看见条带马上终止显影，自来水冲一下马上放入定影液，希望对你有帮助。

• tangxin_80 (2014-1-19 10:49:37)

  你好，我也正在做一个分子量为265kd的蛋白，一次都没有结果，你跑的分离胶多大浓度？我用的6%的胶，每次转膜完了压根看不到marker条带，胶上膜上都看不到，所以不知道转膜该用什么条件，考染有时候看的到250kd上方有条带，有时候又看不到，郁闷啊，也许咱们可以交流一下

• bangqi_k (2014-1-19 10:50:18)

  我采用半干法转膜，考虑到怕易烂，用的8%的分离胶，前天转膜6h效果还是不好，立春红染色感觉好像没有转过去，今天准备过夜转，不知道会不会烧坏仪器。准备转过去之后，再进一步优化封闭和抗体条件。

• bangqi_k (2014-1-19 10:50:35)

  我采用半干法转膜，考虑到怕易烂，用的8%的分离胶，前天转膜6h效果还是不好，立春红染色感觉好像没有转过去，今天准备过夜转，不知道会不会烧坏仪器。准备转过去之后，再进一步优化封闭和抗体条件。

• zbboom (2014-1-19 10:50:59)

  
  楼上的，我也做的250KD左右的，结束了。实验是比较难出一次很好的，重复性不是很高。分离胶7%-8%就可以了，低了不好。胶脆的很。浓缩胶4%。Marker建议用国外的，刚开始用的2个国内的都不好，强烈推荐2个国外大分子Marker，伯乐的10-250的，fermentas的20-250的，2个都不错。我用的前面的伯乐的很好，80/120v电泳等250到中间停，半干转2h，15V.一抗也必须国外的，效价很好，我们用的以色列的alomone，推荐1：200，我稀释到1：1000都没什么问题。国内的2抗1：10000。洗膜时间要充分。

• bangqi_k (2014-1-19 10:51:22)

  QUOTE:

  原帖由 zbboom 于 2014-1-19 10:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  楼上的，我也做的250KD左右的，结束了。实验是比较难出一次很好的，重复性不是很高。分离胶7%-8%就可以了，低了不好。胶脆的很。浓缩胶4%。Marker建议用国外的，刚开始用的2个国内的都不好，强烈推荐2个国外大分子Marker，伯乐的1 ...

  15v，2h能转过去吗？我的20v，6h好像都没有很好的效果，我用的是biorad的半干转仪

• zbboom (2014-1-19 10:51:55)

  晕死，超过2h会烧坏机子的，你没看说明书么？、
  只要转膜液没问题，肯定能转过去的了，我一般1h45min就停了。。
  最好湿转，但是我湿转了3次都失败了，就坚持半干，也没大问题的

• bangqi_k (2014-1-19 10:52:22)

  QUOTE:

  原帖由 zbboom 于 2014-1-19 10:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  晕死，超过2h会烧坏机子的，你没看说明书么？、
  只要转膜液没问题，肯定能转过去的了，我一般1h45min就停了。。
  最好湿转，但是我湿转了3次都失败了，就坚持半干，也没大问题的 ...

  哦？这样哦！呵呵见笑了，机子是实验室以前买的，说明书早不见了，我的转移buffer:SDS0.1%,甲醇10%可以吗？

• ero11 (2014-1-19 10:54:27)

  
  我做的分子量是220kd的，都不敢用8%的胶，用的都是6%的，各位250以上的都用8%的，胶是很脆但手法好的话是坏不了的，总比做不出来要强，再有这么大分子量我建议不要用半干转，用湿转挺好的，湿转的话55V，0.75mm的胶2h，1.0mm2.5h，1.5mm3h就可以了，我一直用的是湿转，刚开始做的时候用的也是半干，一直没做出来，后来导师亲手交给了湿转（感动），结果出来了，后来在没用过半干，几乎每次都做出来了，后面的步骤和小分子量的是一样的。
  如果是初学者建议先不要做这么大分子量的，容易受到打击，可以先做actin先把条件摸好。
  在有你的背景那么高，是不是TBST配错了或者是抗体有问题，一般是不会这样的，目的条带出不来也不至于背景这么高。

• 小螺号 (2014-1-19 10:55:06)

  
  不知道楼主经过调整之后现在这个抗体做得怎么样了，我现在也在做一个175kd的蛋白，同样背景很深，看不到目标条带。封闭之前用丽春红染过膜，目标蛋白也没有染出来。现在觉得很疑惑，是不是目标蛋白浓度太低，如果在这样的情况下调整抗体浓度有没有意义。急求各位老师的指导！

• 101010 (2014-1-19 10:56:15)

  是钠通道吗？不知道进展如何啊？我现在也在进行中，关注！

• misswu61 (2014-1-19 10:56:36)

  
  我最近也在做大分子有289，不过用的是湿转，效果还可以，就是转膜时间很长需要4个半小时，建议楼主改用湿转试下
  看了楼主的图片，我以前有一次显影也是一片黑的，但原因更大可能出在显影上，你试试换下显影液和暗室的光线问题，有时候自己的不注意有可能造成曝光也会这样的。

• zhubinglin0311 (2014-1-19 12:49:44)

  以前做290kda的时候感觉so easy