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【求助】蛋白样品在分离胶呈柱状弥散，请大家分析下原因
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进入分离胶后就开始弥散，呈长方形柱状，越来越长，最下面有红色条带，今天就没转膜，做了个考染，先用固定液固定后放染色液摇床过夜，，，，
请大家分析下原因，谢谢！
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【求助】蛋白样品在分离胶呈柱状弥散，请大家分析下原因
【求助】蛋白样品在分离胶呈柱状弥散，请大家分析下原因
字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-1-22 14:47 作者: zhenxin 来源: 分析测试百科网
最新回复
tuuu2 (2014-1-22 14:48:03)
上样空两边加同样体积的1X上样缓冲液就没问题了。
zhenxin (2014-1-22 14:48:23)
今天看经考染发现条带在分离胶上部分较清晰，越到下面越模糊，和跑电泳时越到下面越弥散好像有关系哦？
duoduo (2014-1-22 14:52:45)
你可以逐一排除，第一，甘氨酸不好用；第二，分离胶pH不对（这种可能性最大）；第三，如果你的样品都有这个问题，那就要考虑是不是你的处理缓冲液有问题；第四，检查一下电泳仪的电压是不是稳定。第二种情况我遇到的次数不少，因为实验室人多，把分离胶缓冲液污染了。
tuuu2 (2014-1-22 14:53:07)
taoshengyijiu (2014-1-22 14:56:59)
今天看经考染发现条带在分离胶上部分较清晰，越到下面越模糊，和跑电泳时越到下面越弥散好像有关系哦？
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根据凝胶分离的原理，你分离到下面就越来越模糊，就是分子量越小越模糊，说明你选择的凝胶浓度筛孔偏大，不适宜分离小分子量的目的样品。
PINK (2014-1-22 14:59:23)
请问在浓缩胶里样品扩散，不能成一条直线，可能是什么原因，谢谢啦！
taoshengyijiu (2014-1-22 14:59:51)
QUOTE:
在不连续电泳中，样品在含有高于它的pH缓冲液中进行电泳。此时样品以负离子形式存在，它在浓缩胶中（pH略低于样品）被高度浓缩呈薄层而实现提高分辨率的目的。例如：待分离样品是血清蛋白，浓缩胶用Ph6.7的Tris-HCl Buffer 配制，电泳Buffer用ph8.3的Tris-甘氨酸，配制。
电泳开始以后，我们待分离的样品蛋白在进入pH6.7的浓缩胶中，在电场和电泳Buffer的共同作用下解离成负离子向正极泳动。同时电泳Buffer中的甘氨酸，因为其等电点为6.0所以在此过程中只有少部分解离（0.1-1%）成负离子向正极泳动。同时浓缩胶中的HCl解离度最大，几乎全部释放出氯离子向正极泳动。
根据电泳有效泳动率的公式；解离度（α）与泳动率（m）的乘积等于有效泳动率（mα）。在本次不连续电泳体系中，氯离子的有效泳动率最大称为快离子，甘氨酸电离出的负离子有效泳动率最小称为慢离子，而样品中的各种成分蛋白质的有效泳动率则介于快、慢离子之间。
因此在电泳开始的时候，快离子快速向正极泳动，慢离子和样品蛋白离子泳动滞后，因此在快离子后面形成一条离子浓度较低的低电导区域。由于电导与电势梯度成反比，因此在此区域产生了较高的电势梯度，由于泳动率（m）与电势梯度呈正比，使得慢离子和样品离子根据其α的大小，有序的加速向快离子靠拢，最后在进入分离胶的时候形成我们通常见到的压缩现象。
所以，压缩现象不能形成的主要原因是：
一、 缺乏快离子，浓缩胶中的Buffer 失效。
二、 缺乏慢离子，电泳Buffer 的pH 不适当。
三、 电泳样品上样量过大，超过浓缩胶中Buffer的缓冲容量。
zhenxin (2014-1-22 15:00:54)
QUOTE:
我检测的是17.5kda和30kda的蛋白，用的是4%和12%的胶，请问你说的凝胶浓度偏大是不是我要用更低的浓度？请问大概是什么浓度的，谢谢你！xue258 (2014-1-22 15:01:18)
QUOTE:
用15%分离胶吧taoshengyijiu (2014-1-22 15:01:45)
QUOTE:
选择6%和15%的胶比较合适。【求助】蛋白样品在分离胶呈柱状弥散，请大家分析下原因