【求助】考马斯亮蓝G250测蛋白质

最新回复

• 49888 (2014-1-22 15:06:09)

  
  用考马斯亮蓝G250测蛋白时要注意操作时间，最好用ELISA板，测定样品时要同时，快速加入，因为不同时间，考染的结果是不同的，这样会造成很大的误差！
  还有要做梯度稀释。尽量多稀释几倍，这样结果比较准确!
  good luck!

• rxcc33 (2014-1-22 15:06:35)

  
  我测过很多次，结果都还可以，把我的经验给你参考：
  1）首先蛋白母液要准，这个一个是母液浓度可以配高一点，体积稍微大一点，不要觉得浪费BSA，用的时候再把高浓度的BSA稀释到0.1mg/ml等其他浓度；
  2）稀释的过程中体积尽量大一点，如果用ELISA板的话，测量的时候一般加200-250ul，你可以采用1ml的体积稀释，如果用分光光度计，那更好，体积可以用5-10ml，体积越大误差会越小；
  3）制作标准曲线时低浓度时要尽量多做梯度，我的经验在0，5，10，20，40，60 ug/100ul蛋白浓度条件下线性关系最强 （浓度太高测得的偏差也会有点大），我基本上每次线性回归R2的值都在0.995以上，所以你可以做这个范围内的标准线，再把你的蛋白稀释到这个范围，这样得到的结果更可靠。
  注意以上操作，再注意每次加样量上的精确性，我觉得得到比较稳定的结果应该不会太难的。

• 00无名指00 (2014-1-22 15:07:47)

  请问可以把你们做的标准曲线图给我看看吗？

• 66+77 (2014-1-22 15:09:45)

  
  我给出一个我用ELISA测得的一次结果，其实用分光光度计测的值更好，这个OD值的绝对值跟你所用的方法有关，还有你用ELISA板测时加样量也有关，例如100ul，200ul，250ul值相差很大，我给出的是加200ul的值，另外，当时为了读数方便，用酶标仪测时没有消零，不过设了没加BSA的0对照 （没调零就b值偏大一点而已），结果供你们参考吧。我个人觉得主要还是方法上注意，溶液配制不一样值也不一样，但只要是使用同样的溶液，你的样品的值就可以套在你用这套溶液所做的标准曲线上，但如果是用不同的溶液，甚至同一母液不同时候稀释过来的使用液，标准曲线都要重做，所有操作要严谨。

  
  48018895.jpg

• 00无名指00 (2014-1-22 15:10:19)

  
  请问你们给猪注射过蛋白质吗？

• wood533 (2014-1-22 15:10:52)

  
  不知道楼主解决问题了没，能不能反馈一下
  用CBB G250的就是Bradford法吧，有个很严重的问题不知楼主注意了没，如果BSA是用裂解液稀释的话：
  Bradford法测定蛋白浓度受蛋白样品中的一些化学物质的影响，即使是非常低浓度的去垢剂。但是裂解液中往往含有较高浓度的去垢剂，如：SDS，NP-40，TritonX-100。
  我用RIPA提的蛋白分别用BCA法，Bradford法测过，差别确实不小啊。
  呵呵。我总结裂解液提的蛋白都不适合用Bradford法测定蛋白浓度。

• 66+77 (2014-1-22 15:11:21)

  QUOTE:

  原帖由 wood533 于 2014-1-22 15:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  不知道楼主解决问题了没，能不能反馈一下
  用CBB G250的就是Bradford法吧，有个很严重的问题不知楼主注意了没，如果BSA是用裂解液稀释的话：
  Bradford法测定蛋白浓度受蛋白样品中的一些化学物质的影响，即使是非常低浓度的去垢 ...

  这种情况可以将BSA溶解于裂解液中来制备标准曲线，我测度裂解液中含有CHAPS蛋白的浓度，结果是没有问题的，我感觉主要是参照的标准严不严格。

• ukonptp (2014-1-22 15:12:08)

  我把染液过滤一次以后，基本上稳定了。不过只达到了两个九