【求助】Ni-NAT柱子纯化蛋白

最新回复

• 12xunmei (2014-1-22 15:13:37)

  
  重做载体，在你编码序列后面再加几个HIS

• ero11 (2014-1-22 15:15:14)

  
  另外可以试试IDA基团的NI填料，也就是市面上那些公司宣称的高载量NI填料。
  IDA基团的NI填料，对HIS的吸附力强，尤其是4，5个HIS的
  NTA对还原剂和EDTA的耐受力强，但是对HIS蛋白的吸附量稍微低点

• summerxx (2014-1-22 15:15:33)

  
  我的蛋白只能加4个his，否则结构会改变。我现在用的是5-prime的Ni柱，不知道哪家的柱子是高载量的？谢谢指点

• ero11 (2014-1-22 15:16:08)

  我的蛋白只能加4个his，否则结构会改变。我现在用的是5-prime的Ni柱，不知道哪家的柱子是高载量的？谢谢指点
  
  ========================================
  
  进口的有GE NOVAGEN QIAGEN
  国产的有北京韦氏色谱

• duoduo (2014-1-22 15:20:13)

  我的蛋白只能加4个his，否则结构会改变。我现在用的是5-prime的Ni柱，不知道哪家的柱子是高载量的？谢谢指点
  如你所说，那么你的蛋白HIS标签多半不是游离在蛋白表面的，所以标签多了才会影响结构的变化，像这种情况一般情况是很难用HIS纯化，即使用IDA也不一定能挂柱，但是可以试试。不行的话建议改变HIS的位置。另外我自己配置了一个NI柱纯化的试剂，是专门针对不挂柱的情况配置的，可以有效帮助挂柱以及提高挂柱效率，对蛋白结构没有影响。如果你愿意试试，你出运费，我就给你发点，你用过后给我一个反馈就行了啊

• ero11 (2014-1-22 15:20:41)

  QUOTE:

  原帖由 duoduo 于 2014-1-22 15:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我的蛋白只能加4个his，否则结构会改变。我现在用的是5-prime的Ni柱，不知道哪家的柱子是高载量的？谢谢指点
  如你所说，那么你的蛋白HIS标签多半不是游离在蛋白表面的，所以标签多了才会影响结构的变化，像这种情况一般情况是很 ...

  说的比较在理，假如你的4HIS标签真的被包裹住了，那是很难在非变性条件下亲和纯化的。
  这种情况下，你只能改变标签的位置或者换标签了。
  假如情况没那么糟糕，只是发现4HIS标签的亲和效果不好，那可以改用IDA的亲和填料或者在BINDING BUFFER中加入1-2M的尿素等变性剂或者2-ME（前提是对你的蛋白活性没影响），来帮助暴露你的4HIS标签，帮助和NI离子结合

• am10 (2014-1-22 15:21:01)

  
  上面几位大虾说的，小弟不重复了。值得一试！
  但是如果你目前想赶进度，可以试一下用尿素等变性剂预处理一下样品，然后以上述高载量柱，进行纯化。阶段洗脱，然后柱上梯度复性，再sds-page看一下效果。
  除杂时的阶段洗脱可以设计间隔小一些，多几个阶段。

• summerxx (2014-1-22 15:22:01)

  
  我试过用8M的尿素，但是似乎效果不好，还是有很多杂蛋白。谢谢大家指点

• yjf1026 (2014-1-22 15:22:28)

  
  可以这样：
  1， 保守的方法，用不同的离子去螯合柱子（Cu2+, Co2+, Zn2+）,前面两个离子，颜色有显著特征，用起来比较方便。
  2. 重新构建载体，His TAG 最后用酶切掉（切后不残留多余氨基酸的酶切位点较好）. 其他Tag 载体也可以用。
  另外不知道楼主为什么说6HIS 为影响结构，而4HIS不会，有实验证明，还是预测的？