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【求助】阴阳离子柱纯化蛋白（PI=7.6），蛋白纯化不出来
【求助】阴阳离子柱纯化蛋白（PI=7.6），蛋白纯化不出来
本人有一蛋白，包涵体形式存在，分子量16.7KD，等电点7.6
1.阳离子柱CMFF纯化，将蛋白溶解在9M尿素中，调PH=4.0，BufferA,B,C的PH=4.0，过柱子后，蛋白大部分存在于穿透液中，有部分蛋白挂柱，但是随着Buffer B盐离子浓度提高达到1 M NaCl，只洗下杂蛋白，没有多少目的蛋白，而用NaOH洗柱的时候，能把挂在柱子上的目的蛋白洗脱下来，蛋白挂柱子量太少？挂柱子后用盐洗脱不下来？
2.阴离子柱High Q纯化，将蛋白溶解在9M尿素中，调PH=8.3，BufferA,B,C的PH=8.3，过柱子后，蛋白大部分存在于穿透液中，有部分蛋白挂柱，但是随着Buffer B盐离子浓度提高达到1 M NaCl，只洗下杂蛋白，没有多少目的蛋白，而用NaOH洗柱的时候，能把挂在柱子上的目的蛋白洗脱下来，蛋白挂柱子量太少？挂柱子后用盐洗脱不下来？
两个柱子几乎都是同样的现象，蛋白不是穿透，就是虽然结合在柱子上，但是用Buffer B盐离子浓度提高达到1 M NaCl，洗下来的都是杂蛋白，目的蛋白很少，而用NaOH洗柱的时候，能把挂在柱子上的目的蛋白洗脱下来，请大家分析一下原因，谢谢了。
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最新回复
flower-201 (2014-1-22 16:40:55)
稀释到多少倍上柱 尿素浓度
DONT (2014-1-22 16:42:33)
没有复性 当然在穿过
你看看是不是应该稀释到0.2M尿素
misswu61 (2014-1-22 16:50:38)
几乎没有进行稀释，里面含有少量DTT，酸溶的加了醋酸后调PH值，碱溶的加了少量Tris调PH值。
Buffer B，A里面尿素8M
flower-201 (2014-1-22 16:53:24)
没有复性 当然在穿过
你看看是不是应该稀释到0.2M尿素
misswu61 (2014-1-22 16:54:21)
flower-201 (2014-1-22 16:54:50)
我做过8M尿素的southQ 纯化 可以
但与未加尿素有些差别
8M尿素的CMFF 不挂柱
尿素做为离液剂在离子交换中还是有影响的
蛋白浓度太高 即使纯化好了 复性也是不容易操作的
蛋白浓缩用超滤或冻干都可以 纯化的目的就是纯化 精纯
而且上样体积无关 柱体积一定 最大负载一定 洗脱体积是差不多的 何必自寻烦恼
misswu61 (2014-1-22 16:55:30)
谢谢你哈，8M尿素的CMFF 不挂柱？为什么？
你做包涵体，过离子交换柱，是怎么做的?
misswu61 (2014-1-22 16:55:58)
又作了一次目的蛋白还是不挂住，大家提提意见哈
skytree (2014-1-22 16:56:21)
我的看法，从两方面来分析：
1、挂柱的目标蛋白——可能尿素并没有将目标蛋白溶解完全。
这可以从你溶解IB时电泳上清样和沉淀样来估计。表现为溶解上清中虽然有目标蛋白，但在沉淀中仍然有大量目标蛋白不能溶解。这样的话，溶解上清中的目标蛋白很可能仍处于一定的聚集状态，而不是单体。通俗地讲，就是还是颗粒，不具备单体的电荷性质。特别是IB溶解上清只是离心，没有经过过滤时，上样离子交换柱，这些颗粒沉积在柱头，并非真正依赖电荷作用吸附到柱上。提高盐浓度不能洗脱这些沉积颗粒，而用氢氧化钠时，沉积蛋白变为可溶被洗脱。
2、不挂柱的目标蛋白——可能存在目标蛋白的修饰
这是经验性的推测。有些蛋白IB表达后，用尿素溶解时，可能会形成尿素修饰，不带电荷的尿素覆盖在蛋白质的表面，从而掩盖蛋白的电荷性质。或在大肠杆菌中表达时，就形成了小分子的表面修饰。
我多次碰到这种情况，不只是IEC柱不能吸附，其它类型的柱，如金属鳌合柱（目标蛋白有histag）、疏水柱等都不能有效吸附。这类蛋白一般都是疏水性很强的膜蛋白。
建议在表达载体和诱导条件方面做些改进，拿到可溶性的蛋白表达，再做纯化。
misswu61 (2014-1-22 16:56:41)
蛋白经过离心后上清直接上柱子，上清看起来就是比较粘稠，好像胶体，好像聚集在一起，不是以单体的形式存在，但是经过0.45um的滤膜后，蛋白还是比较粘稠，蛋白经过柱子的时候，大部分还是穿透了，这是为什么呢？希望高人给予解答
有的时候穿透有两个峰，从穿透的样品看来，第一个峰里几乎没有目的蛋白，第二个峰里目的蛋白很多，那说明柱子上也结合很多蛋白，但是用盐还是洗不下来哈，这是为什么呢？
skytree (2014-1-22 16:57:01)
另一种可能，调节pH时导致样品的电导过高，检查一下。
misswu61 (2014-1-22 16:57:25)
skytree (2014-1-22 16:58:18)
30moonriver (2014-1-22 16:59:12)
本人有一蛋白，包涵体形式存在，分子量16.7KD，等电点7.6
1.阳离子柱CMFF纯化，将蛋白溶解在9M尿素中，调PH=4.0，BufferA,B,C的PH=4.0，过柱子后，蛋白大部分存在于穿透液中，有部分蛋白挂柱，但是随着Buffer B盐离子浓度提高达到1 M NaCl，只洗下杂蛋白，没有多少目的蛋白，而用NaOH洗柱的时候，能把挂在柱子上的目的蛋白洗脱下来，蛋白挂柱子量太少？挂柱子后用盐洗脱不下来？
2.阴离子柱High Q纯化，将蛋白溶解在9M尿素中，调PH=8.3，BufferA,B,C的PH=8.3，过柱子后，蛋白大部分存在于穿透液中，有部分蛋白挂柱，但是随着Buffer B盐离子浓度提高达到1 M NaCl，只洗下杂蛋白，没有多少目的蛋白，而用NaOH洗柱的时候，能把挂在柱子上的目的蛋白洗脱下来，蛋白挂柱子量太少？挂柱子后用盐洗脱不下来？
两个柱子几乎都是同样的现象，蛋白不是穿透，就是虽然结合在柱子上，但是用Buffer B盐离子浓度提高达到1 M NaCl，洗下来的都是杂蛋白，目的蛋白很少，而用NaOH洗柱的时候，能把挂在柱子上的目的蛋白洗脱下来，请大家分析一下原因，谢谢了。
实验方案设计有问题啊！包涵体的纯化不能根据理论的来。你可以尝试一下不同PH下做CM层析，不同PH下做Q层析。摸索清楚初步PH然后优化，同时注意样品的电导不要太高。
30moonriver (2014-1-22 16:59:33)
蛋白经过离心后上清直接上柱子，上清看起来就是比较粘稠，好像胶体，好像聚集在一起，不是以单体的形式存在，但是经过0.45um的滤膜后，蛋白还是比较粘稠，蛋白经过柱子的时候，大部分还是穿透了，这是为什么呢？希望高人给予解答
有的时候穿透有两个峰，从穿透的样品看来，第一个峰里几乎没有目的蛋白，第二个峰里目的蛋白很多，那说明柱子上也结合很多蛋白，但是用盐还是洗不下来哈，这是为什么呢？
层析纯化，蛋白样品是不能过高的，蛋白那么稠在上样时容易沉淀在层析柱上。你的操作步骤没有很好的表述出来，让人不好分析
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