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【求助】为什么电压达到了预定值聚焦的横纹还是很多呢
【求助】为什么电压达到了预定值聚焦的横纹还是很多呢
请各位站友帮忙看看我的这两张图啊 两个样品的处理环境是一致的，就是不是同时跑的。胶条是伯乐pH4-7 7cm的
裂解液：尿素8M，CHAPS 4%，DTT 65mM，IPG buffer（4-7）2%，cocktail 1%
水化液：尿素8M，CHAPS 4%，DTT 65mM，IPG buffer（4-7）0.5%，痕量溴酚蓝
上样量分别是300微克（第一张）和85微克（第二张）。
两个样品的IEF程序是不太一样的，第一张图设定的最高电压是8000v，为的是电压能够升的高一点，但聚焦时电压一开始也只有两千多伏，后来有所上升，在3000v左右聚焦了一段时间；而第二张图多设置了一步低压除盐程序，并且在低压时更换了两次paper wick，设定的最高电压是4000v，顺利升压，但就图的效果来看聚焦的还是不好，不太明白是什么原因 是不是应该延长IEF的时间，特别是聚焦时间呢？ 希望能得到战友们的指教，在此谢过啊！
[ 本帖最后由 qqshepherd 于 2014-1-24 15:40 编辑 ]
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【求助】为什么电压达到了预定值聚焦的横纹还是很多呢
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最新回复
qqshepherd (2014-1-24 15:41:30)
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greenbee (2014-1-24 15:42:02)
应该是聚焦时间不够，增加8000v聚焦时间!同时我也怀疑你的制样有问题，图上的点很少。建议再银染看看，有没有更多的点出来。
ending (2014-1-24 15:42:21)
qqshepherd (2014-1-24 15:42:42)
我也一直觉得点数少，之前也试过上样量大的（600微克左右吧），但图像基本都是在胶的酸性端和中部，在偏碱性端基本就是空白了，对这个问题很困扰 接受站友的建议，银染试试看 谢谢楼上热心的两位啊！
qqshepherd (2014-1-24 15:43:24)
非常郁闷啊，用同一批次的样品（-20℃保存）重复了一次实验，上样量95微克，聚焦伏时28000，电压却没有升到4000v，聚焦时电压只在2000v左右，2D图如下，横纹仍然存在，碱性端蛋白点也仍然很少。
这次水化上样前，为了使蛋白充分溶解，我将-20℃样品置于室温过夜，测定浓度后发现蛋白浓度（约11mg/ml）比刚刚制备出样品时测定的浓度(约12mg/ml)要低一点，是因为冻融导致蛋白降解吗？我对2楼的胶进行快速银染后发现，碱性端低分子量区域是有一些蛋白质斑点的，但高分子量区域仍是空白，这和蛋白的降解有关吗？还是有其他什么原因（比如一向转二向时操作问题）？还请大家赐教啊，再次谢过！
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qqshepherd (2014-1-24 15:43:42)
下面这张是银染的图，染色过头了，酸性端横纹非常多，但碱性端小分子量区出现了一些斑点
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abc816 (2014-1-24 15:44:04)
只是达到预定电压（最高电压），但不一定达到最合适电压*小时数，这个你也要考虑一下的，而最后一张图片横纹这么多，感觉应该不仅仅是聚焦电压和时间的问题，估计还有样品提取、水化等的问题
wood533 (2014-1-24 15:44:31)
这个图 用扫描仪吧 不能分析 白忙了
qqshepherd (2014-1-24 15:45:36)
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恕我愚笨啊，不知道能不能请2D站友解释的更加明白一点呢？我的第二张图达到了预定电压，但聚焦的伏时数不够；第三张图提高了伏时数，可是电压没升上去，弄得我有点无从下手了啊...是不是最终的问题还是在样品的制备上呢？我的制备流程基本和文献上一致：超声破裂——静置增溶——高速离心——超速离心——上清分装后-20℃保存，这个可能是裂解液的问题吗？或者是平衡的问题？最后一张银染的图上除了横条纹，还能看到一些淡淡的纵条纹，麻烦站友指教啊，多谢多谢了！
flower-201 (2014-1-24 15:49:16)
kuaizige (2014-1-24 15:49:36)
楼主做的是什么样品？不同的样品图谱差异很大，像膜蛋白就很难跑，图一般都好不到哪去。楼主可以参考一下已发表的文章中相同样品的2-D图谱。
qqshepherd (2014-1-24 15:50:03)
照楼上站友所说的标准，我的聚焦伏时是有差距啊，我8000v只聚焦了24000vh，看来条件还有很多地方需要改进，样品制备也是一样，我觉得点不多应该还是和样品的提取有关系，继续努力吧 给自己加油 呵呵！
还有一个问题，我对IPG胶条也进行考染染色脱色后发现碱性端染色较深，那么我二向胶上碱性端蛋白点少会不会是一向转二向的操作上有问题呢？操作问题会出现空白胶的状况吗？
再次感谢站友，感谢给予我建议的各位同仁！
qqshepherd (2014-1-24 15:50:23)
我又回来了...
我把菌种重新活化后再制备样品，仍是7cm胶条pH4-7，上样20微克，银染后发现点的确增加许多，但仍然是大约pH5.5以上的区域就是空白，这种菌是一种芽孢杆菌，参考文献上它的胞内蛋白基本就是分布在pH4-7的区域内的。我还做过另一种芽孢杆菌的2D，样品制备方法是一样的，图谱质量高出很多，所以对于第一种菌碱性区域空白的情况很是百思不得其解，再次有请大家发表高见啊，不甚感激！
下面这张图第二向时跑过了，前沿丢失
15775264.jpg
qqshepherd (2014-1-24 15:50:47)
[ 本帖最后由 qqshepherd 于 2014-1-24 15:56 编辑 ]
88011957.jpg
huifeng0516 (2014-1-24 15:58:59)
请教一个问题：线性增压那一步，一开始老在250V左右徘徊了一个小时，后来突然上2000多，再慢慢到最大电压，是不是正常的？
谢谢1]
qqshepherd (2014-1-24 15:59:52)
H2O (2014-1-24 16:00:18)
谢谢
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我也是新手来的，这种情况没有遇到过啊，线性升压那步一直都是线性升上去的 还得有请前辈来解答你的问题啊 帮不上忙啊...
qqshepherd (2014-1-24 16:01:09)
我有点郁闷的是跑了这么多次2D，只有一次电压升至预定值，而且用相同的样品重复实验时电压居然又升不上去了。我上面跑的最好的那张图的样品曾用别人的仪器跑过，聚焦的非常好，基本没有横纹，可再用自己的仪器跑就不行了，电压徘徊在2500v左右，而且电流达到50微安（电流基本次次都要达到极限值） 我觉得是仪器的原因，不知道其他站友有何高见？
但令人欣喜的是，改进时虽然电压也达不到预定值，但上样量小，聚焦伏时足够，所以聚焦的也还可以，这时深刻体会了2Dproteome站友所说的：合适的聚焦伏时数也很重要
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