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【求助】western 条带连成一条线
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本人做western 遇到了各种各样的问题，这次的主要问题是，条带连成一条线。
一抗为内参。蛋白上样量均为50ug，左边4个是我自己的蛋白，后边的8个是借别人的。ECL一分钟。曝光时间10秒左右吧。
翻了下园子里以前的帖子，建议是：1、上样量过大，2、上样时间过长，样品扩散。3、电压过大，发热至扩散。
分析我自己可能存在的问题：
1、上样量50ug，因为借了别人的样本，他做是好的，所以，我想是否应该排除上样量过大的原因。
2、上样时间过长。我这次上样时间确实较以往长了4分钟左右，总共10分钟吧，因为加样加的格外仔细。
3、电压。我一直用的都是恒压的，80V。
今天在做一次，打算减少上样量，加快上样时间。
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最新回复
txwuyan (2014-1-24 21:17:13)
上样量太多或者胶浓度太低
abc816 (2014-1-24 21:17:36)
如果是上样量 拉梯度看看
我建议你换个人操作一下 感觉两次实验的问题
并没非我们想的那样
ero11 (2014-1-24 21:17:55)
上样量大所致，我以前也出现过
ffaa (2014-1-24 21:18:21)
恒压跑不是很好吧，先60V跑一会，等看到到了积层胶与分离胶分层线那里后换100V再跑，看看会不会好点。这个情况我以前也有过，上样量过大可能是原因，你最好换一批蛋白浓度高的蛋白，这样每个上样孔里面就可以少加点，到时候会跑的好点
nn255 (2014-1-24 21:19:13)
你的是什么蛋白样品呀，本人感觉细胞抽提的蛋白容易弥散，上样量还好吧，我们一般都是上这么多的，我的抗体不行，一般都上到150微克呢，条带也蛮好的。
jujuba (2014-1-24 21:19:33)
降低上样量，加大 电压。
同时要注意加样时尽量不要溢出来，建议用进口长枪头加样。
还有缩短曝光时间，也可能出来好的结果。
seagate (2014-1-24 21:19:53)
50ug上样量是大了，我们一般用30就可以；如果只是爆内参建议可以试试60V过基层 后换80~100跑；不知你用的板是哪种，例如我们实验室的10孔梳1mm厚，实际上样量为28ul以防止加样时样本的溢出扩散；如果以上问题都排除建议可以先检查一次BUFFER。
birdfish (2014-1-24 21:20:29)
我上样量减到30ug，连线的问题确实解决了。多谢各位了。
有什么问题再继续请教哈
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