【求助】破菌蛋白降解

最新回复

• hustwb (2014-1-24 21:26:08)

  
  我是做BL21的全蛋白提取~ 没法帮你什么~
  不过我想问问你没有加别的裂解液么。。？光用Tris-HCl就行？
  能否麻烦你把实验过程发给我一份呢~~谢谢
  我用的是论坛里说的细菌裂解液
  感觉跑出来的条带比你的差远了
  不过降解的倒是不多
  你注意温度了吗~~？

• dreaming (2014-1-24 21:26:48)

  
  我用的是PBS缓冲液。裂解时间你可以超声1分钟停1分钟，降温，冰上进行

• zbboom (2014-1-24 21:27:21)

  有些蛋白融合标签表达后,目的蛋白和标签很容易就分开了,很不稳定,即使很快将目的蛋白纯化出来,纯化后的蛋白也很容易分解成标签和目的蛋白,很有可能你的这种表达后的融合蛋白就不是很稳定而降解成你红框中标注的第三条带和另外一条标签带,不知道你的标签蛋白分子量多少.
  如果你想看看你的蛋白是否是离开细菌就分解还是破碎后经过一段时间才分解的,建议你在实验过程中注意以下几点:
  1)在整个操作过程中保证低温环境,特别是破碎过程中的降温.
  2)大肠杆菌的破碎条件没有必要那么剧烈(200W,20min),一般大肠杆菌的壁很好破碎,5min足够了,过长的破碎时间也有可能使不稳定的蛋白降解.
  3)破碎后的样品建议马上进行变性电泳检测分析,以免样品过长时间放置引起降解.
  个人见解,希望对您的实验能有点帮助!

• ha111 (2014-1-24 21:28:13)

  我用200W，20min主要是因为我们实验室的都是用的超声条件都是400W，45min的，不过蛋白不一样，可能结果影响蛮大的，我明天就试试吧，O(∩_∩)O谢谢啦！

• biabiade (2014-1-24 21:28:39)

  建议如下，供参考：
  1 完全冰上操作
  2 200W，1min 休息30s 间断超声 累积时间达到10min或更短 保证蛋白得到即可（使获得蛋白的条件更加温和）
  3 适当加蛋白酶抑制剂
  4 蛋白立即电泳分析或立即存于－20度以下保存

• sunnyB (2014-1-24 21:29:00)

  感觉楼上所说的超声时间都太长
  超声波破碎仪连续工作1min是个什么概念，产热有多高？？？（破碎仪说明书上怎么说的？）
  这样肯定对蛋白的稳定性有影响的。
  我们这普遍用的程序是工作3s 停 5s （6号探头），或者工作1s 停1s （3号以下探头），整个过程完全冰水浴，一般的如果蛋白是可溶性表达有个60个循环足够了（算起来工作时间就是3min）。
  如果有专家路过，还恳请指导到底哪种方法合适。

• ha111 (2014-1-24 21:29:18)

  
  ( ⊙ o ⊙ )啊！，这样啊！那我马上试试，可能就是我的蛋白不太稳定，加上超声时间又太长了，所以蛋白就成图上那样的了。

• biabiade (2014-1-24 21:29:37)

  
  问下楼主 “诱导后”的那条带的样品就是直接用菌液点的样吗？

• ha111 (2014-1-24 21:30:34)

  QUOTE:

  原帖由 biabiade 于 2014-1-24 21:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  问下楼主 “诱导后”的那条带的样品就是直接用菌液点的样吗？

  是啊，诱导后的菌液直接处理上样电泳。