【求助】总是转膜不干净!

最新回复

• 张先生 (2014-1-24 22:52:27)

  
  自己先来顶下!
  因为一起转的同学都能转干净,因些分析原因有下面几个:
  1、我做三明治时出现了问题？一般我做三明治可能赶气泡不是特别的干净（教训啊），但是也不至于会全部都转不干净呀？我们的海棉都是用三到四层的，也就是说整个三明治夹起来是好紧的，不会是不能太紧吧，滤纸一般放二层！
  2、转移的时间不够？但大家的经验，两个小时一般都够了吧，呵呵，因为我的转移不干净是整张膜都还有条带，不论大小分子量的，再说同学的都够了，为什么我的会不够？
  3、。。。。。。。。。。。。。真想不出其它的！
  还有一个问题就是我估摸内参时（B-ACTIN）会出现泳道丢失的现象，或者是明显不均一的情况！请大家分析啊！谢谢！！！

• bling (2014-1-24 22:52:49)

  
  不知道你的转膜液配方是什么，我一般用的是
  10X转膜液：
  甘氨酸（MW75.07） 29g(39mmol/l)
  Tris-base（MW121.14） 58g(48mmol/l)
  SDS 3.76g(0.037%)
  蒸馏水至 1L
  溶解后室温保存，可重复使用 3～5 次（最好4℃，最多使用 5 次）
  4℃保存>6月
  应用液：甲醇200ml+10X转膜液100ml+双蒸水700ml
  我们是恒流80mA，电压就能达到70V，第一次可能达到80V。我的蛋白78KD的转1.5h -2h 就可以了。多转一会儿也没事，PVDF膜是很难转过的。

• eric930 (2014-1-24 22:53:14)

  
  转膜不干净应该是因为电阻过大。
  请问楼主用的胶是不是自己做的？如果是自制的胶，可能是胶的密度不均匀或者你同学的胶和你的胶聚合程度不同。气泡没赶干净可能膜上有个和气泡形状大小一致的干燥斑，在胶片上可能会显出对应的影子。
  建议你单独转一次膜，只用自己的胶。做好三明治以后滴几滴转膜缓冲液在滤纸上。滤纸上下各用一张厚的一张薄的，或者每面只用一张3mm的厚滤纸。一定要赶尽气泡。

• eric930 (2014-1-24 22:53:47)

  1.即使有些气泡，只要不是特别大的，杂出来的条带都应该能看见的。 另外， 海绵有必要放3-4层嘛？太紧了也不好！
  2.转移时间与你的目标蛋白有关

• 张先生 (2014-1-24 22:54:09)

  
  相关疾病：
  水疱
  谢谢大家的回复，对以上大家提的问题，我在这里一一回复：
  1，转移液没有问题，和你们提供的是一样的
  2，我们用恒流200MA，电压第一次可以到达80+-90+，第二次可能就只有60+了，再往下就一直往下掉，不知道楼上的提供的80MA能达到这么高的电压吗？呵呵
  3，至于胶肯定是自己配的，而且我同学的也是我配的，我们每人配一次的，浓度也一样，是12%的
  4，最后我怀疑是不是我的膜泡的时间不对，或者是因为程序不对，我用的是NC膜，提前一般用双蒸水泡20分钟，然后直接放入转膜，其实我同学他们也是这样做的，为什么我不行呢？
  5，海棉不能放太多？为什么太紧了不好？紧点不是可以贴得更紧有利于转膜吗？还多多请教！
  6，还有就是以前感觉条件一样，可以转移干净的，就这两次，经常转后染胶好象没有转膜的胶一样，呵呵，条带清楚！
  谢谢大家！
  最主要的一点就是，我同学和我一起转的，转移液，胶都可以说是一模一样的，只有膜可能自己处理的。。。但是处理方法一样呀，只是自己要的大小自己剪而已 。。。。。。。

• eric930 (2014-1-24 22:55:51)

  
  1.我们的转膜液，等会我去看看转膜仪是什么型号的，80mA第一次70V左右，第二次60V，第三次50V（不是绝对的）。我最多用过三次，有同学用过四次，电压只有40V多的时候也转的很好。
  2.我曾经垫过两层海绵，有个WB老手用了那个转膜槽，她说海绵点多了效果不好，具体她也不知道，只说是经验。

• qhyu (2014-1-24 22:56:08)

  
  楼主会不会是膜和滤纸相差太大的原因吧，又一次我转的时候膜搞得太大了，当时比较菜就没管，结果转完了marker还留在胶上

• vera+ (2014-1-24 22:57:51)

  
  同意楼上的观点。我也有类似。错了之后自己反思：W是印迹方法，至少要保证你的泳道后面有滤纸支持才能印上，否则最直接影响了膜与胶的紧贴。还有要防止你的玻板对胶的污染。膜应该之前用甲醇活化至少10s，本身是疏水的变为亲水的，时间久一些没关系。我们实验室是单层海绵的，2～3层滤纸做三明治。电转液我们是现配现用，之前要在-30度预冷，电泳槽中放冰盒。整个转膜过程在冰浴中进行。不知你的蛋白是多大的分子？我的是110kd，电转液中加入0.1%SDS增加转膜效率，300ma，2.5h转膜很干净的。自己感觉恒流较恒压转膜产热少些，要保证转膜环境中的温度，冰化了要及时添加，否则要影响转膜效率，对仪器也损耗。我也是新手，只知道这些啦，一起敬待高手指点！

• 张先生 (2014-1-24 22:58:13)

  
  呵呵，谢谢各位的关注，基本上找到答案了，确实是如最后几位所说，因为我一直把胶、膜和滤纸的大小搞错了，原来一直胶最大，滤纸和膜差不多大小，但肯定比胶小很多，因为没有切胶，又为了省滤纸和膜，所以。。。。。。。。。前几天一直出现这样的问题，找老师好几次，最后发现了，不过我现在还有问题就是到底要怎么样来确实这三者的大小关系呢？
  当时老师是这样解释的，他说胶是一个电良好的导体，所以肯定是漏电了，所以转不过，现在我的做法是滤纸适当小点，胶可能比滤纸大一点点，膜再比胶大一点点，因为怕滤纸相交，所以没办法，不知道这样行不行，请各位指点。。。。。。。。。。
  还有就是这两天跑电泳感觉又不行了，跑得一团糟，自己想想没有什么不同的地方呀，原来跑得条带很清楚的，现在基本上看不清楚了，染胶后，再觉得只是自己换了一个PH6。8的TRIS，是不是因为这个PH不准导致的呢？
  还有就是MARKER跑得很好呀，因为换的东西是用来配浓缩胶的，如果不行的话肯定会MARKER一样出现不好呀？
  再有一点就是发现最后跑的胶染时在胶的中间会出现一条很强的染料，很粗，不知道什么原因，想明天再跑下确认一下，因为样品前几天刚跑过的，很好。。。。
  有答案再来告诉大家，。。。。。。。。谢谢大家的关注。。。。。。。。。

• 张先生 (2014-1-24 23:00:53)

  现在又出现问题了,跑电泳总是跑不开,MARKER可以,但是蛋白没有,现在基本上可以明确胶出现问题了,但是最近只是新配了一个PH6.8的TRIS,前天配的,然后今天去校准的时候发现是7.0,,
  不会因为这个导致的吧?
  谢谢大家

• seagate (2014-1-24 23:01:51)

  
  首先如果排除下层胶浓度没有问题的话，很有可能是这个原因，因为当PH=7时属于中性，甘氨酸在此环境下解离仍很少，这样整个环境还是像浓缩胶里一样，蛋白质处在氯离子和甘‘氨酸之间，始终处于压缩的情况下，所以很难跑开。

• 张先生 (2014-1-24 23:02:48)

  
  谢谢楼上的,我现在重新配了,又发现了一个问题,哪就是你加酸时,有时PH到了稳定几分钟后又会升上去>
  这是怎么回事呢?
  谢谢.........

• 张先生 (2014-1-24 23:03:59)

  
  还有一个哪就是我们的电泳液换了,不是我自己配的,不知道有没有出现问题,如果电泳液出现问题会这样吗?>
  谢谢...............

• 张先生 (2014-1-24 23:04:24)

  另外一个问题就是我的PH6.8的是用来配浓缩胶的,所以应该与分离胶无关,也就是说分离胶的东西是绝对没有变化的,只是浓缩胶出现了一个变化,然后就是电泳液换了新的...................
  能不能详细说下电泳的原理？
  谢谢。。。。。。。

• remenb (2014-1-24 23:04:59)

  
  你能不能把你所说的跑胶跑的一团糟明确说一下，究竟是怎么糟糕了？我又一次跑胶的时候，溴酚蓝跑成了一片蓝往下跑，最后我再园子里面找了找，发现有战友提出胶配好要放置一段时间，使胶充分聚合，问题就解决了，不知道能不能帮上你。

• damingxia0904 (2014-1-24 23:06:09)

  
  我觉得既然你自己都觉得这些是要问题的环节，何必将就来做呢？电泳液有问题当然是会影响你的电泳的，这是毫无疑问的！我认为不如把这些自己觉得不稳妥的地方换成稳妥的，之后没有结果才好分析啊，不然，我认为没有意义的。

• 张先生 (2014-1-24 23:07:09)

  
  呵，谢谢大家的分析，现在问题基本明确，是电泳液出现了问题，所以现在电泳没有问题了，但是转膜却一直不行，真不知道哪里出现了问题，我在另外一个贴里发了几个图片上去，欢迎大家讨论啊！