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【求助】HSP70蛋白做不出来。。。
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一开始用多抗做了，但是出的是两条带，很近。
所以改用单抗。
可是，改用单抗跑蛋白梯度，50，100，150ug时，什么条带也没有。
接连跑了好几次都什么也没有。
样品在-80度冻存，应该没有啥问题。其他的步骤，想不起来有哪里不对。
求助做过相关蛋白的战友支个招。谢谢啦~~~~~
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-1-25 17:40 作者: yyaxw84 来源: 分析测试百科网
最新回复
yyaxw84 (2014-1-25 17:41:28)
买一抗的公司说是让1：100加。战友们给点意见啊。。。
skytree (2014-1-25 17:41:47)
yyaxw84 (2014-1-25 17:42:11)
QUOTE:
我现在是单抗，用的鼠二抗。。。8s5g (2014-1-25 17:42:36)
我觉得如果蛋白没有降解的话，
也可能是蛋白自身的问题，由于变性或其他一些过程使得抗体结合位点被封闭了，从而导致检测不到，多抗可以检测到而单抗检测不到，也有可能多抗和单抗针对的蛋白上的位点不同，这也是很有可能发生的，可以换一个1抗再试试，2抗如果没过期，出问题的可能性不大
祝好运！
yyaxw84 (2014-1-25 17:42:58)
QUOTE:
谢谢你的分析。还有问题求教：1.我在坐骨神经中上样量30ug就可以检测到。同一批的其他组织（大脑，小脑，脊髓）没有检测到，上样量达到了400ug.是不是可以说明组织中蛋白没有降解或降解很少。
2.查到的文献，主要是中文文献，用的免疫组化的方法检测到，科里师兄们认为，他们的数据不可靠。WB方法很少用。如果真用免疫组化的方法检测到的话，WB是不是一定能检测到。
3.HSP70不是一个广泛的应激蛋白吗？为什么在脑组织中等检测不到呢？只有刺激才能产生吗？
期待您和其他战友的解答。
PS:多抗做出来的有点不太确定是不是。没有加marker。只是在那个区域里有带。
谢谢。。。
8s5g (2014-1-25 17:43:55)
QUOTE:
1。不知道HSP70是否在坐骨神经中高表达，而在其他组织中表达量低？这个我没查过不清楚，你可以去查查，但根据你描述的，这个很有可能，还有你在3中提到的，HSP70是应激蛋白，那是很有可能需要刺激才能表达，或者刺激后表达量会增加；2。免疫组化没有做过的说，但感觉原理跟WB都是一样的，下面一总结，你可以参考，
“Western，In-cell Western，ELISA以及immunochemistry虽然是不同的实验技术，但是基本原理是类似的，都是为了检测目的蛋白，将目的蛋白固定在支持物上，利用特异性的第一抗体识别，与不同标记的二抗反应放大信号后利用不同手段检测
只不过支持物不一样，有膜（WB），96-well plate（ICW/ELISA）或者玻璃板（immunochemistry）；标记的二抗不一样，比如HRP、AP、Biotin、Alex、IRDye、FITC。。。。。。。；或者检测的手段不一样，比如读板仪、荧光显微镜或者上面说的LI-COR的扫描仪等等
另外这些实验各有优缺点，有的简便、通量大（ELISA/ICW），有的可以反应细胞内的蛋白情况（ICW/immunochemistry）而不是cell-free的试验（ELISA/WB），有的能够区分出目的蛋白的分子量（WB）等等等等，因此需要根据实验目的的不同来选择不同的实验方法，以达到快速准确的拿到自己想要的结果” ---From Small （cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=14020389&sty=1')）
3。见1，机体代谢是一个很复杂的过程，很多反应都是需要刺激产生的，要不就都成了‘管家’的了，你现在所做的一切都是在探索你未知的东西，所以所有发生的现象都有可能是事实，就看你怎么去解释，怎么去解决了；
祝你好运哦~~~
yyaxw84 (2014-1-25 17:44:18)
QUOTE:
昨天新匀浆的组织，做了，上样量>300ug,没有做出来。今天打算用HSP70的多抗再做一遍看看。到底是怎么回事。有点晕。。。呵呵
等老板回来好好讨论下。
再次感谢
yjf1026 (2014-1-25 17:44:52)
第2种为HSC70（热应激同源蛋白70，heat shock cog-nate 70），也称为HSP73，是哺乳动物细胞内的结构蛋白，在所有的细胞内均能表达，并且受热诱导，属于结构型HSP70。
不知道楼主选择的抗体是针对哪一种的，如果是针对诱导型HSP70的话，你还没有诱导，那可能比较难做出。
yyaxw84 (2014-1-25 17:46:16)
QUOTE:
我用的抗体是HSP70，用单抗，多抗都试过，能做出来。但是单抗带很弱，不好做。抗体批次一换，就变的很难做了。
glass (2014-1-25 17:47:11)
这是我公司的HSP70多抗检测结果
是否能满足需要呢？
28642648.jpg
yyaxw84 (2014-1-25 17:47:48)
QUOTE:
不好意思，做出来的还不如我多抗做出来的漂亮呢。。。呵呵问一下，你们有HSP27抗体吗？
还有100ul 多少钱？那个公司的？谢谢
【求助】HSP70蛋白做不出来。。。