【求助】蛋白有表达,但是无活力,下一步怎么办?


我的蛋白有表达,但是没有活力,奇怪了!麻烦大家指点一二!谢谢!

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  • langlang (2014-2-03 10:55:10)

    QUOTE:

    原帖由 greenbee 于 2014-2-3 10:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    我的蛋白有表达,但是没有活力,奇怪了!麻烦大家指点一二!谢谢!

    说的太过简单,比如什么蛋白啊等,也可看哪个人做过,会提供一些信息。
    不过就蛋白没活性,这个问题,首先要确保检测方法是否可行,灵敏度是比较关键的,有些蛋白在原核中表达的活性比较低,或量比较低,就需要很大的蛋白量,或更灵敏的检测方法,我以前做过一个酶,在原核中表达的活性只有真核的百分之一,所以检测很不方便,当然,如果活性太低,也没意义,换系统;
    还有就是蛋白的测活体系确保没问题,一些盐,离子都会影响酶的活性,比如添加了什么离子活力会很高,当然,如果您有阳性对照,而且没问题,当然可以排除这些。
    以上这些都是在您的蛋白表达正确,序列没问题,纯化都没问题的前提下的改进。
    祝好运!
  • greenbee (2014-2-03 10:57:34)

    谢谢您的回复!
    我表达的是E.coli K-12的UNG,我把它克隆到15b上,采用BLP作为表达宿主,诱导表达后采用溶菌酶裂解,然后去上清测活。核酸序列一测序没有问题,测活体系没有问题,表达量也没有问题,但是就是没有活力!真郁闷!
  • greenbee (2014-2-03 10:57:57)

    QUOTE:

    原帖由 langlang 于 2014-2-3 10:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')


    说的太过简单,比如什么蛋白啊等,也可看哪个人做过,会提供一些信息。
    不过就蛋白没活性,这个问题,首先要确保检测方法是否可行,灵敏度是比较关键的,有些蛋白在原核中表达的活性比较低,或量比较低,就需要很大的蛋白量,或更灵敏 ...
    对了,还有就是可以换不同载体,但是我不太明白这个原理是什么?能指点一下吗?
  • langlang (2014-2-03 10:58:26)

    QUOTE:

    原帖由 greenbee 于 2014-2-3 10:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')



    对了,还有就是可以换不同载体,但是我不太明白这个原理是什么?能指点一下吗?
    这个说实话我也没有太多的经验,只能去尝试下,有过这种情况,即使氨基酸序列一样,可合成的基因没活性,逆转录得到基因则有活性;
    换载体就是换真核的系统啊,可你的基因好像是来源于原核,所以应该没那必要了。
    我能说的就这些:)
    祝您好运!
  • xueyouzhang (2014-2-03 10:58:51)


    是不是形成了包涵体?
  • greenbee (2014-2-03 10:59:11)


    包含体我考虑过,但是包含体应该是降低了活力,而不应该是没有活力啊!
  • ukonptp (2014-2-03 10:59:32)


    包涵体是没有活性的aggregation
  • greenbee (2014-2-03 10:59:57)


    那怎样减少包含体表达呢?或者怎样证实?谢谢