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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-2-03 10:54 作者: greenbee 来源: 分析测试百科网
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原帖由 greenbee 于 2014-2-3 10:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '') 我的蛋白有表达,但是没有活力,奇怪了!麻烦大家指点一二!谢谢!
原帖由 langlang 于 2014-2-3 10:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '') 说的太过简单,比如什么蛋白啊等,也可看哪个人做过,会提供一些信息。 不过就蛋白没活性,这个问题,首先要确保检测方法是否可行,灵敏度是比较关键的,有些蛋白在原核中表达的活性比较低,或量比较低,就需要很大的蛋白量,或更灵敏 ...
原帖由 greenbee 于 2014-2-3 10:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '') 对了,还有就是可以换不同载体,但是我不太明白这个原理是什么?能指点一下吗?
最新回复
langlang (2014-2-03 10:55:10)
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说的太过简单,比如什么蛋白啊等,也可看哪个人做过,会提供一些信息。
不过就蛋白没活性,这个问题,首先要确保检测方法是否可行,灵敏度是比较关键的,有些蛋白在原核中表达的活性比较低,或量比较低,就需要很大的蛋白量,或更灵敏的检测方法,我以前做过一个酶,在原核中表达的活性只有真核的百分之一,所以检测很不方便,当然,如果活性太低,也没意义,换系统;
还有就是蛋白的测活体系确保没问题,一些盐,离子都会影响酶的活性,比如添加了什么离子活力会很高,当然,如果您有阳性对照,而且没问题,当然可以排除这些。
以上这些都是在您的蛋白表达正确,序列没问题,纯化都没问题的前提下的改进。
祝好运!
greenbee (2014-2-03 10:57:34)
我表达的是E.coli K-12的UNG,我把它克隆到15b上,采用BLP作为表达宿主,诱导表达后采用溶菌酶裂解,然后去上清测活。核酸序列一测序没有问题,测活体系没有问题,表达量也没有问题,但是就是没有活力!真郁闷!
greenbee (2014-2-03 10:57:57)
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对了,还有就是可以换不同载体,但是我不太明白这个原理是什么?能指点一下吗?langlang (2014-2-03 10:58:26)
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这个说实话我也没有太多的经验,只能去尝试下,有过这种情况,即使氨基酸序列一样,可合成的基因没活性,逆转录得到基因则有活性;换载体就是换真核的系统啊,可你的基因好像是来源于原核,所以应该没那必要了。
我能说的就这些:)
祝您好运!
xueyouzhang (2014-2-03 10:58:51)
是不是形成了包涵体?
greenbee (2014-2-03 10:59:11)
包含体我考虑过,但是包含体应该是降低了活力,而不应该是没有活力啊!
ukonptp (2014-2-03 10:59:32)
包涵体是没有活性的aggregation
greenbee (2014-2-03 10:59:57)
那怎样减少包含体表达呢?或者怎样证实?谢谢
【求助】蛋白有表达,但是无活力,下一步怎么办?