【求助】蛋白纯化后浓度太低怎么办？

最新回复

• 101010 (2014-2-03 11:53:26)

  
  11KD还不算很小，用超滤咯，膜包选1kD的

• ritou1985 (2014-2-03 11:53:45)

  用PEG20000浓缩，透析袋选择分子量小于你目的蛋白分子量的（8000或者更小）
  方法是将你要浓缩的蛋白加入到透析袋中，然后将透析袋直接放入有少量PEG20000的器皿中（要直接接触），整个过程在4度冰箱中进行，浓缩时间看你的透析袋的大小，一般几个小时即可，切忌浓缩时间过长以至蛋白干燥

• wmp1234 (2014-2-03 11:54:17)

  
  谢谢各位，由于实验条件有限，（没有透析袋等）如果用亲和层析的方法，能够再通过优化条件来纯化吗？

• biabiade (2014-2-03 11:54:34)

  
  如果只是想看到条带的话，用银染吧。
  如果想吧蛋白浓度提高一点的话，纯化时减少凝胶的体积，增加洗脱液中的咪唑浓度。

• yes4 (2014-2-03 11:54:50)

  个人觉得还是表达条件和纯化条件没摸好！
  还是从这两个方面着手，否则都是空谈，再浓缩怎么弄都不行啊，SDS-PAGE都看不出条带来，一点意义没有啊

• chuntian1983 (2014-2-03 11:55:08)

  
  如蛋白之安基所言，优化表达和纯化是王道。
  估计你的表达量量不是很高，能不能通过换载体提高表达量呢，事实上，10K多一点的蛋白的确不是很好表达。我折腾一个9K的多肽很久了，就是量太低，现在基本放弃。
  表达没有问题了再考虑纯化。
  如果你仅是要一点点蛋白做个小实验，到也可以通过亲和富集来实现。貌似你的蛋白洗不下来，我是猜得，呵呵。
  是不是结合力太强呢？你加尿素是这个目的的吧？500mM的咪唑一般都是可以的了。也可以尝试加NaCl看看，是不是有离子作用。
  是不是还有一种可能，你的蛋白质疏水性比较强啊，这样的话就不是很好办了，可以先用相关软件预测一下。

• bling (2014-2-03 11:55:25)

  想问一下，可以通过什么软件分析蛋白质的疏水性可抗原决定簇？

• jiushikeshui371 (2014-2-03 11:57:26)

  如蛋白之安基所言，优化表达和纯化是王道。
  估计你的表达量量不是很高，能不能通过换载体提高表达量呢，事实上，10K多一点的蛋白的确不是很好表达。我折腾一个9K的多肽很久了，就是量太低，现在基本放弃。
  如果真是表达量低话，换载体能提高表达量嘛？能否举个例子说说，谢谢。换载体的话又是通过什么方式提高了表达呢？

• zbboom (2014-2-03 11:57:51)

  
  增加诱导菌液体积，然后用更少的洗脱液浸泡柱子，然后离心得到高浓度的洗脱蛋白。

• nn255 (2014-2-03 11:58:23)

  想问一下，可以通过什么软件分析蛋白质的疏水性可抗原决定簇？
  
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  DNA Star 软件 还比较好用，试试吧