【求助】NC膜曝光一次后可以洗脱后再曝一次光吗？

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-2-03 19:09 作者: xevin 来源: 分析测试百科网

转膜后用立春红染色看到了蛋白条带，但是后来曝光的时候加完ECL看不到荧光，因为加ECL的时候，在加完A液后因为时间耽搁了一会才加B液，不知道是不是这个问题，导致最后看不到荧光，胶片显影时任何条带也没有。想问一下NC膜可否在曝光结束后用TBST洗三遍重复再曝光一次呢？偶是新手，第一次做，不知道问题出在哪里，请各位高手指点一下，在下不胜感激！

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abc816 (2014-2-03 19:09:40)

最好重新杂一下二抗，40min，再显影
youreyes (2014-2-03 19:10:01)

如果第一次一抗与二抗孵育的好的话
不用重新杂交二抗
用TBST可以把ECL的底物洗去
用TBST多洗几次就行，没问题的
好运
ffaa (2014-2-03 19:11:38)

有时候不是说染胶的时候看到蛋白带就可以了，
一抗二抗孵育的不好发光的时候还有可能看不到条带的，
重新做一定要孵育好，那样很轻松的就可以看到蛋白带了。
你说的先加了A过了段时间在加的B那个影响不大。
xevin (2014-2-03 19:11:57)

谢谢各位指点，我想用洗后再重新孵一抗二抗曝光看看。
dhpbj (2014-2-03 19:12:14)

这样做得用stripping buffer
damingxia0904 (2014-2-03 19:12:32)

我最近用过，试试这个配方吧：100 mM ß-mercapto-ethanol, 2% SDS, 62.5 mM Tris-Cl pH 6.8
50mlbuffer当中：
ß-mercaptoethanol 342 µl
20% SDS 5 ml
Tris-Cl pH6.7 3.125 ml
add H2O to 50 ml
50° 30min
祝你好运
xevin (2014-2-03 19:12:56)

谢谢，我用TBST洗了三遍，每次十分钟，然后重新孵一抗二抗，重新显影，结果把整张膜都显出来了，虽然也有条带，不知道是什么原因，我做了两次都是这样的。难道是膜没有洗干净吗？
zwsyrt (2014-2-03 19:13:29)

1可能是你的ECL 太多了，注意加完用滤纸吸一下。
2曝光时间延长可以看到膜的边缘的，把曝光时间和显影时间缩短一下
xevin (2014-2-03 19:13:46)

谢谢楼上战友的回答，我想就是ECL底物没有洗干净，导致发光，因为这次我孵完抗体没有发光，就压片过夜，看到膜也显出来了，估计就是ECL底物发光和压片显影时间长的原因。看来W的经验是要慢慢摸索出来的。