【求助】还是没条带

最新回复

• kuohao17 (2014-2-03 20:37:31)

  
  抗体不好吧估计，Santa的抗体就没几个能用的，换CST或者ABCam的抗体试试看吧

• 831226 (2014-2-03 20:37:54)

  QUOTE:

  原帖由 星星点灯 于 2014-2-3 20:37 发表
  
  快被WESTERN折腾死了,一个多月了,只出现过两次条带.最近的结果很奇怪,就是膜边缘荧光很亮,亮得开着红灯都看得见,暴光结果就是很黑很黑的一大片,或者边缘是黑的中间没条带.好了,把我实验流程说一下 :
  分子量70KD,转 ...

  这是典型的背景太高，发生这种情况主要有以下几点：
  1）二抗浓度太高，建议把二抗提高到1：10000；
  2）一抗有非特异性结合！建议，第一次洗膜要充分，譬如ＴＢＳＴ三次十分钟；
  3）做个阳性对照看看，排除以下操作的原因！
  祝顺利！

• 星星点灯 (2014-2-03 20:38:16)

  
  说实话抗体应该没问题，因为我做出来过几次，问题是同样的条件下有的就做不出来了

• guagua (2014-2-03 20:38:37)

  
  根本原因是你抗体浓度太高了。
  一抗你尝试下1：1000
  二抗你尝试下1：50000
  尤其是二抗，我们实验室都是1：100000稀释的，绝对过量。
  二抗洗膜再用TBST多洗一次。
  你前面能做出结果，说明抗体问题不大。但是我推测你以前所做的结果背景肯定也很高。
  你最好把图拿出来给大家看看。

• skytree (2014-2-03 20:38:58)

  
  是啊，一分钱一分货，还是要买好一些的抗体。
  有人买了七八个santa的抗体，一个没做出来，投诉也没人给解决。以后再不敢用。
  还是abcam的比较好一些，即使做不出来也会及时给解决的。

• qhyu (2014-2-03 20:39:17)

  
  我觉得 一是你抗体浓度可能高了点 二是你发光液可能加的太多了 或者压片时间长 要是太亮 可以等荧光粗灭时间长点 再压片

• 079777chao (2014-2-03 20:39:51)

  1.样品太多
  2.抗体太浓
  ECL检测灵敏度，本人做到了0.05ng

• eric930 (2014-2-03 20:40:19)

  
  抗体浓度也改了很多次了,现在一抗1:800.二抗1:10000,洗的时间也长了。但是出来的片子还是一片黑.....真不知道为什么,快一个月了,崩溃

• coolcool (2014-2-03 20:40:38)

  封闭不好，是不是你转膜以后膜的周边干了？milk你用了多少？我用50ml的离心管5ml就可以了，稳妥起见用7.5ml到10毫升