【求助】重组蛋白可溶，但无活性，请帮帮忙

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• yueban-1147 (2014-2-03 20:52:07)

  带有GST标签，酶切正切，你说的酶切是切除标签吧？还是构建过程中的限制性酶切？融合蛋白的标签最好切掉，不然很难排除对活性干扰。
  既然是可溶怎么又要复性的呢？不明白。最好是拿到一点可溶表达的组分先测个活力。包涵体复性等确证蛋白没问题了再去优化。
  HPLC纯化?不知你采用的是哪种HPLC，要注意的是一般的蛋白质可能在乙腈作用下失活，这个也是目前RP在蛋白大规模纯化领域应用不广泛的原因之一。

• jude (2014-2-03 20:52:29)

  我没有说清楚，我做的蛋白分子量比较小，所以在反相HPLC中不会变性。
  表达纯化酶切标签后，上hplc进一步分离找到活性峰，检测了活性 。
  但是活性峰的比例很小，所以老板希望我能够做一下refolding,提高一下产量，进行更多的检测
  就是想提高活性蛋白的比例，我已经做了好久，实在不知道怎么做了，请帮帮忙

• guagua (2014-2-03 20:52:48)

  
  还是建议上游改进做分泌表达

• PPT (2014-2-03 20:53:06)

  分子量很小，应该属于多肽的范畴了吧，RP-HPLC一般每问题。
  活性峰占得比例很小？refolding？
  难道是可溶表达量太少，希望包涵体表达再复性？这条路不是好方法，个人感觉。复性不好做。能拿到可溶的先做可溶的吧。
  或者你的意思是怀疑多肽构象不对，希望再折叠形成正确构象提高活力？这个我没有尝试过，不好评价。
  你前面一个GST很大，自己的目的肽段很小，得到的产物应该不会很多（可以自己算算看，目的肽段占融合蛋白的多少）。酶切也不是万能的，有时会切割不完全，还有错误酶切的存在。
  融合表达往往给人一个假象，得到很多的融合蛋白，但最终得到的目的多肽往往并不是很多，而且那个酶往往很贵，这条路做做科研还可以，想工业化貌似很难。我曾经做个一个蛋白，摇瓶每升就拿到500mg以上的蛋白，最终得到的多肽还是很少，你可以做个借鉴。

• jude (2014-2-03 20:53:29)

  分泌表达？
  不太了解，之前有个学长试了一下pmal系统，希望能在细胞周质表达，但渗透休克法后并没有得到蛋白，就是超声破菌后的蛋白量也很少。
  还应该寻用那谢谢系统或是方法？

• jude (2014-2-03 20:53:56)

  7KD的大小，酶切后1L菌有3mg的产量，但目的蛋白构象不均一
  形成一个鼓包， 用dtt打开活性峰含量极少，所以希望通过重折叠使得有活性的峰比例加大。
  帮帮忙

• PPT (2014-2-03 20:54:20)

  
  大概懂你的意思了，7K的多肽表达纯化。
  分泌表达在大肠不是优势，可以尝试枯草，这个我也没做过。
  你说的是周质表达吧，这个也不是很容易，pET里面有几个也可以做到，只要前面有SP就可以。但这种方法也很尴尬，表达量高了就形成IB，太低就没意思了。
  多肽杂合性很麻烦，在液相上形成一个鼓包？什么液相？是不是也存在脱乙酰化或者别的一些问题，倒不是Cys造成的了，这个我也是猜测。
  二硫键多吗？三对以上就不推荐重折叠了，太麻烦。
  有个多肽-水蛭素，貌似65AA左右，有二硫键，加信号肽分泌表达效果很好，仅供参考。

• zhezhe (2014-2-03 20:54:38)

  
  有四对二硫键，相当痛苦。
  HPLC时是一个鼓包。。
  您说的分泌表达，尝试枯草，我不太知道，有相关的资料嘛？
  麻烦你