【求助】转膜屡次不成功

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• ffooll (2014-2-03 22:59:40)

  
  个人感觉预染MARKER相对容易转些，你的目的蛋白52 转膜160mA 1h 湿转，感觉时间不够，电流也较低。可以试试恒压100v，2h，我一直用这个，效果很好，电流在200mA以上，转膜后期可达300mA以上。如果恒流160mA，电流也不高，建议提高电流，适当延长时间，分子量越大，转膜就相对难些。我很少用丽春红染，如果转膜好，可以通过膜的反光看到相应的泳道。供参考。

• ffooll (2014-2-03 22:59:58)

  个人感觉预染MARKER相对容易转些，你的目的蛋白52 转膜160mA 1h 湿转，感觉时间不够，电流也较低。可以试试恒压100v，2h，我一直用这个，效果很好，电流在200mA以上，转膜后期可达300mA以上。如果恒流160mA，电流也不高，建议提高电流，适当延长时间，分子量越大，转膜就相对难些。我很少用丽春红染，如果转膜好，可以通过膜的反光看到相应的泳道。供参考。

• coolcool (2014-2-03 23:00:39)

  MARKER容易转，蛋白52 转膜160mA 1h 湿转，可能电流不够。最同意“我很少用丽春红染，如果转膜好，可以通过膜的反光看到相应的泳道”，事实上，我们lab根本就没有丽春红。我也用恒压100v，不过通常小于1.5小时。个人认为 ，时间越长，电泳仪产热多，蛋白或者透过膜，或者质量受影响，最后WB效果并不见得好。另外，Milliproe的protocol中，转膜前转移buffer平衡gel的时间与转移时间/效率条图非常有借鉴意义，建议参考。

• bs4665 (2014-2-03 23:00:58)

  
  我感觉与你用的膜有关，我用的得是NC膜，蛋白为95，转膜150mA 2h 湿转就差不多。如果你的是PVDF膜则可能要加大电流，我同学一直用三百多mA转蛋白 2h。你可以试试。

• uaubc (2014-2-03 23:01:17)

  
  预染makrer转得好, 而其他条带没有转过去的事我也遇到过,
  我的原因之一是转膜液中没有加SDS, 加入后, 延长时间(300mA 3 小时,32kD),
  并更换新了的膜, 就转好了(有时可能是多种因素, 比如膜开封时间长,又是公用,可能保存不善) .
  如果是pVDF膜, 在甲醇中多激活一下(如5分钟).

• birdfish (2014-2-03 23:01:38)

  
  将叫和PVDF膜放好后，转膜五分钟 marker就可以转移到膜上去。所以marker只能作为蛋白分子量的标记 不能用来衡量蛋白是否转膜成功。。湿转建议恒流350，90分钟。装置置冰中。。

• hustwb (2014-2-03 23:01:56)

  
  你转出来了吗？我的是53kd也是转膜老失败，郁闷惨了，传授下经验，谢谢

• newway (2014-2-03 23:02:43)

  MARKER容易转，蛋白52 转膜160mA 1h 湿转，可能电流不够。最同意“我很少用丽春红染，如果转膜好，可以通过膜的反光看到相应的泳道”，事实上，我们lab根本就没有丽春红。我也用恒压100v，不过通常小于1.5小时。个人认为 ，时间越长，电泳仪产热多，蛋白或者透过膜，或者质量受影响，最后WB效果并不见得好。另外，Milliproe的protocol中，转膜前转移buffer平衡gel的时间与转移时间/效率条图非常有借鉴意义，建议参考。
  
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  赞同！
  我也根本不用丽春红
  因为它的灵敏度并不高，可能跟考染相当，而用ECL检测最近做，灵敏度达0.02ng，用TMB/H检测，灵敏度也达到0.5ng,用丽春红根本达不到它的检测灵敏度。
  我们43k的蛋白，80V，两小时恒压，转得很好。

• caihong (2014-2-03 23:03:05)

  
  建议碎冰中恒流250mA，1至2小时

• 雪花子 (2014-2-03 23:03:31)

  我们这么大的分子量用300ma的1h从不失手。