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【求助】现在该怎么思考？
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前面的实验结果表明某蛋白在我的实验处理过后在蛋白水平是上调的，有二维电泳和Wwestern的结果支持，但real-time实验结果显示该蛋白的mRNA在实验组中反而下调了将近20%（均有重复三次，细胞株试验），接下来该怎么思考呢？
蛋白的降解减少了？反馈性的抑制了蛋白的表达？
抑制蛋白降解的途径有哪些呢？蛋白酶体？泛素化？那为什么不是所有蛋白的表达上调？
还是有其他的原因？这种情况该怎么思考了呢？
敬请各位老师指点。
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最新回复
yychen (2014-2-03 23:32:57)
RNA下调20%意义不大，看你蛋白上调的量，如果是几倍的往上翻
就加CHX看看是不是蛋白降解变慢了，如果不是，那可能是RNA翻译效率变高了，比较麻烦，如果是，那就是说蛋白降解变慢。
蛋白降解无非是泛素化，sumo化，然后就是用泛素的抑制剂，看能否让你未处理细胞的蛋白水平变多，再IP验证。。。。做到这步大概4、5分差不多。
哈哈，一家之言
ns5fan (2014-2-03 23:33:15)
“CHX看看是不是蛋白降解变慢了”这句话能不能详细点说？CHX是啥？环己亚胺？放线菌酮？能否给点详细的资料？
不好意思，从来没有接触过这方面，很是幼稚阿。
谢谢了。
ns5fan (2014-2-03 23:33:31)
谢谢，豁然开朗。
蛋白合成抑制剂
yychen (2014-2-03 23:33:51)
是放线菌酮啊，先查下文献这个蛋白的半衰期，然后再设计哦：）
ns5fan (2014-2-03 23:34:09)
查了，这个蛋白的半衰期根本就没有文献报道。
问题麻烦了，
1、细胞刺激的浓度怎么确定？直接参考别人的文献？比如说别人在Huh7细胞中用的是某个浓度，我的Huh7细胞也用这个浓度？还是要做个浓度梯度？
2、刺激后的检测时间怎么确定？也在不同的时间点检测？怎么设计呢？分钟为单位？小时为单位？
3、检测的手段，western？用什么做内参呢？这个时候beta-actin什么的也在减少阿。
谢谢楼上。
yychen (2014-2-03 23:34:27)
我用过CHX的浓度好像是2ug/ml的，不过这种东西的浓度一般来说都是过量的才对。我没见过人用浓度梯度。
一般的内参半衰期都很长，24小时内降解的有限，而且就算降解，其他蛋白也是降解的更快的，所以通过蛋白定量了以后是没有问题的。不要担心内参。
时间可以先设计一个梯度，1，1.5，3，6，12，24h，差不多了，另外还要加个对照蛋白，我见过拿p21做对照的。
seagate (2014-2-03 23:34:48)
个人有些不同意见
检测时间很重要，而mRNA和protein的检测时间不一定是一致的，一般情况下，mRNA会在24-48 h检测比较好，而protein要晚一些，在48-72 h检测，一般我做时间梯度为
6h 24h 48 h 72 h。
楼上所说的1-24h可参考，但是个人认为是不够的，供参考
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