【求助】关于煮蛋白的问题

最新回复

• ffooll (2014-2-03 23:56:03)

  
  我是用定了后煮
  有时候WB结果也会有部分条带粗细不一
  但是总体不错
  我觉得是蛋白浓度测定的时候不是很精确造成
  另外就是调整蛋白浓度的时候应该把样品混匀好再取样品

• 流星锤 (2014-2-03 23:56:28)

  
  谢谢楼上的回答。请问你定蛋白的时候注意些什么呢？我之前用的sigma的Bradford，用比色皿来测od，那个时候做出来的直线有0.99，后来用了biorad的Bradford，用96孔板来测od，现在的直线每次只有0.95左右，我不知道是不是这样导致了蛋白定量不准确。

• wawa (2014-2-03 23:56:51)

  
  我们就用碧云天的bca测蛋白浓度的效果比较好，先测蛋白浓度，然后一起煮，煮了之后放在-20摄氏度保存。同意楼上的，其实测蛋白浓度不一定精准，也就是个大致齐的结果而已。
  关于用不同的方法测出od值会不会影响蛋白定量，我觉得不一定，因为就如上面所说的，测量蛋白也不是一个精准的体系，只是一个大致齐的结果。所以，只要是在同一个测量体系中测出来的结果，应该不会有太大的影响。

• damingxia0904 (2014-2-03 23:57:10)

  
  建议用BCA
  测定蛋白浓度后用PBS调整蛋白浓度
  加入样品缓冲液后煮沸，变性
  -20度保存

• 流星锤 (2014-2-03 23:57:30)

  其实BCA与Bradford那个灵敏准确呢？为什么你建议用BCA呢？先谢了！

• fangxiang (2014-2-03 23:57:47)

  BCA可重复性高
  干扰因素少

• xueyouzhang (2014-2-03 23:58:09)

  
  我们是用普里来的蛋白提取试剂盒提的蛋白，我想问一下如何溶解这种膜状的固体蛋白物质呢？我们实验室有人用4%的SDS反复冻融，但是这样溶解比较慢，需要反复冻融好几天，也不一定能够充分溶解，所以我想请教一下大家是如何溶解的？不胜感激！

• xue258 (2014-2-03 23:58:27)

  
  我用BD公司的Cell Lysis Buffer裂解细胞提取蛋白，发现蛋白如果不加Loading Buffer直接煮会产生沉淀，这可能会影响以后浓度的测定，所以我都是先测浓度再加LoadingBuffer去煮，WB结果中beta-actin还可以，不是特别均一，但能够接受。

• fangxiang (2014-2-03 23:58:47)

  
  还有一种办法就是做出来beta-actin后通过beta-actin的IOD值来调整上样量的大小

• huifeng0516 (2014-2-03 23:59:09)

  
  主要还是看样品的量。
  如果是蛋白样品的来源是细胞，那么各个样品的细胞数目相差不大的话，用到的裂解液体积相等，而处理的条件又一致的话，则蛋白浓度可以不去测定，因为我觉得浓度相差很大的条件下，通过测得的浓度去调整上样量也不是很准的。
  还有就是LS说的通过action去调整上样量了
  祝好运哦

• wiwi (2014-2-03 23:59:39)

  我想问一下，如果蛋白不马上run，加了loading buffer后是不是一定要煮一下才储存？不煮对蛋白会有什么影响？

• wiwi (2014-2-04 00:00:01)

  
  仔细看看你的枪头，我发现把枪头伸进0.5ml EP管中，按下去虽然没有松开，但是液体会自动吸上来，再松开吸的话结果就不准了，这种现象尤其出现在用加样液体湿润了以后，往96孔板里打的时候。不信你看看能全部打出去吗？打出去稍稍停留就会吸上不少来。这是造成定量不准的主要原因。

• any333 (2014-2-04 00:00:18)

  
  求助
  我要做动物组织的WESTERN，测一种核内的蛋白。请问用哪种裂解液比较好？我听说过不用裂解液的，请问哪位知道如何操作？谢谢。