【求助】SDS-PAGE问题

最新回复

• kuaizige (2014-2-05 21:24:36)

  
  不离心可能产生2个后果
  1、堵塞泳道，只是电泳无法正常进行
  2、部分的不溶物颗粒进入凝胶，染色后出现拖尾现象，影响效果
  沉淀的东西是部分的不溶物，常常是蛋白。一般并不是加热或者加入上样缓冲液后产生的沉淀，而是蛋白溶液本生已经有沉淀或者浓度过高或者部分蛋白特性决定，在加入上样缓冲液或者加热后产生沉淀。一般情况下出现大量沉淀的现象比较少见

• 简森si (2014-2-05 21:25:28)

  
  谢谢您的解答，
  还想问一下，SDS的作用不是使蛋白变性吗，加热只是促使SDS和蛋白的结合，而蛋白变性的结果是溶解性降低，产生沉淀，但是上样却用上清，那上清里不是就蛋白量很低了吗？

• bluelake (2014-2-05 21:25:46)

  
  SDS是一种阴离子型离子对试剂（阴离子型表面活性剂），
  SDS与变性的蛋白结合，使其带上大量的负电荷，破膜裂解细胞，去垢等作用。
  离心是确保你的、所提取的蛋白中没有可以杂质，以免在上样泡电泳时出现杂带等现象，
  你所说的蛋白浓度低了：可以多加些细胞裂解液使其充分裂解啊！
  最后上清液的蛋白浓度的高低 需要你去蛋白定量，而后就知道该加多少的上样缓冲液啦！

• 简森si (2014-2-05 21:26:09)

  我所说的是已经经过纯化的可溶性蛋白的电泳，样品已经很纯了，出沉淀后不都是蛋白吗，那上清里的成分和沉淀的成分有什么区别呢？

• tie8 (2014-2-05 21:28:56)

  蛋白出现的沉淀一般都是当蛋白的存储条件比如离子强度、PH等改变的时候发生的，即使你的蛋白很纯也有可能出现。沉淀中的蛋白和溶液中的蛋白是一个东西，只是沉淀中的已经变性而已（经验是一般沉淀了即使变回本来的存储条件也不能再溶解或者溶解量很低）。条件改变了并不意味着该蛋白就完全不能在该溶液中存在，所以溶液中也会存在，但常常出现沉淀的时候溶液中的蛋白浓度可能会变的很低

• 简森si (2014-2-05 21:29:21)

  
  但是SDS-PAGE要求是用变性的 蛋白上样呀，如果上清液中的蛋白没变性，不就成了native蛋白电泳了吗？

• birdfish (2014-2-05 21:29:44)

  
  一般情况下，加入SDS-PAGE上样缓冲液后，点样前煮沸5分钟，样品应该变得透明澄清才对，上样缓冲液中的成分都有利于蛋白的变性，二硫键的断裂，溶解，如果仍出现沉淀，只能说明样品处理的不好，可增加SDS-PAGE上样缓冲液的量及相应增加融解蛋白所用的buffer,重新煮沸，也可多次冻融，直到样品中沉淀消失。

• 简森si (2014-2-05 21:30:01)

  如果煮沸后样品澄清，那操作中还需要离心干嘛呀？

• birdfish (2014-2-05 21:30:24)

  
  我做细菌，蛋白样品一般都没有不溶的情况，至于别的样品，就不知道了

• bling (2014-2-05 21:30:44)

  
  那要离心多少转,多少时间才能去除杂质?我是用酵母跑SDS-PAGE,每次都是样品制备出问题,胶上条带几乎没有,泳道上都是蓝的(考马染色).请问有没有酵母蛋白样品制备好的方法

• pou (2014-2-05 21:33:31)

  
  一般情况下是不需要离心的；
  但是有的情况下，样品与loading buffer混合煮沸后，可能存在浑浊，此时应该离心取上清。
  比如，我看到有的人做微粒体蛋白的westernblot，就是把制备好的微粒体蛋白与loading buffer混合煮沸5min后，再离心取上清行SDS-PAGE。

• yychen (2014-2-05 21:33:49)

  
  我一般12000转离心1分钟

• cocacola (2014-2-05 21:34:44)

  在SDS-PAGE电泳中我们需要使抗原抗体复合物变性后电泳，应该如何操作？

• cocacola (2014-2-05 21:35:13)

  
  请问如何防止在电泳过程中出现条带的横向扩散啊？

• wiwi (2014-2-05 21:35:32)

  
  我来回答一下，希望能帮上忙，SDS-PAGE ，在上样前样品+loadingbuffer经沸水浴5min，然后离心（10000-12000）取上清上样。这里楼主请看一下离心转速，只有10000-12000这个速度就算是30000D得蛋白也离心不出去得，如果能看见沉淀或者离心下来得“东西”，那说明沉淀并不是你想要得目的蛋白，同时这些“东西”会堵塞泳道，导致试验结果不佳。
  离心得目的只有一个就是使你得结果更加清晰，至于量会减少那个是次要问题，不足以给你试验带来问题。