【求助】关于caveolin-1

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• bling (2014-2-05 22:16:24)

  
  没做过
  但是感觉不难
  我是专门做WB项目的主管
  santa 的抗体不错
  用几个不同的稀释度做预实验
  1：500，1：1000
  转膜条件是什么？
  缓冲液用了什么？
  可以用25mM tris，192mMglycine，0。1%sds,20% methanol
  300mA，30min
  好运

• nn255 (2014-2-05 22:17:36)

  分子量22kd，这样的条件可以吗？请问楼上的老师

• mingming0638 (2014-2-05 22:18:37)

  是invitrogene 的干转仪吧，时间再短点吧，30分钟

• 2541 (2014-2-05 22:18:58)

  
  我们有做，我现在的老板以前就是专门搞这个的。抗体的选择很重要，不同的抗体差别很大，我们用BD 的一种抗体，货号具体有空再查，信号特别强，我们基本上拿它当western的阳性对照，条件也是一般的：10%的胶，5%牛奶/tbst（吐温我们用0.2%） 封闭1h, 一抗（1：5000）4度过夜，洗3x3min，二抗 1：10000（进口）1h，rt，洗 3x3min，ECL

• 2541 (2014-2-05 22:19:16)

  
  转膜用的是bio-rad湿转， 100v，1h足够了

• bling (2014-2-05 22:19:43)

  
  请问楼上的老师，我用100v biorad 湿转，发现特别热，放上冰块一会儿就融化了，转完摸着滤纸和胶都很热。顺序是黑板-海绵-滤纸-胶-膜-白板 ，然后黑板靠着黑色的转膜仪一侧，有什么问题。转膜液的配方用的EDTA.2na的如下
  先配20*fairbanks buffer
  tris base 49.19g
  sodium acetate 16.41g
  Na2-EDTA.2H2O 7.44g 1L
  取上述50ml，加入10%SDS 2ml 加dd-w948ml为转膜液。
  详见http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=13711619&sty=1
  谢谢指导。

• 2541 (2014-2-05 22:20:08)

  
  转膜温度高主要还是和buffer配方有关，我们以前也碰到过类似情况，在冷库里转膜，后来一看转膜槽里都冒烟了。。。
  我们的湿转配方是 10x储液：90g glycine，19.3g tris,溶解到1L
  配工作液就取100ml母液，加入750ml dd H2O,再加入150ml 甲醇即可，要预先4度冷却。然后100v在冰上转，应该问题不大，你可以试一试。顺序是对的。

• bling (2014-2-05 22:20:31)

  
  谢谢指导，准备按照你的方法做，另问有没有SDS? PH值为多少？我用的biao-rad mini-cell，0.75mm厚的胶，一块和两块是否不同？

• 2541 (2014-2-05 22:29:52)

  
  不用加sds，一块胶两块胶没什么区别。不用调ph值，按配方配出来的ph都很稳定。

• bling (2014-2-05 22:30:28)

  转膜温度高主要还是和buffer配方有关，我们以前也碰到过类似情况，在冷库里转膜，后来一看转膜槽里都冒烟了。。。
  我们的湿转配方是 10x储液：90g glycine，19.3g tris,溶解到1L
  配工作液就取100ml母液，加入750ml dd H2O,再加入150ml 甲醇即可，要预先4度冷却。然后100v在冰上转，应该问题不大，你可以试一试。顺序是对的。
  
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  你好，兄弟。你的转膜液与分子克隆的 25mM TRIS，192（0.2M）mMglycine 20%甲醇有区别吗？我试了一次，没有转上，什么也没有，以前100v的电流0.24左右，换了0.3左右。