【求助】蛋白磷酸化检测

最新回复

• ilovegaga (2014-2-05 23:11:07)

  
  可以用质谱，3级质谱加上中性丢失，可以检测磷酸化肽段，
  但只能相对定量，并且要求重复性很好

• ukonptp (2014-2-05 23:11:42)

  
  首先我解释下楼上战友所提供的方法， 他的意思是例如通过一级质谱可发现与肽段分子量理论值相差80 Da (HPO3=80 Da) 的质谱峰, 该峰的二级质谱图中如果母离子与旁边的最高强度的质谱峰相差98 Da (中性丢失H3PO4=98 Da), 则可确定该肽段为磷酸化肽段, 进一步通过二级或多级质谱的谱图确认具体的磷酸化位点。
  而楼主所提到的用抗磷酸化蛋白的抗体进行Western blot检测, 具有特异性好、分辨率高的优点, 至今还是常用的手段， 目前除了以上2种方法以外， 还有：
  1. Pro-Q Diamond dye，此小分子染料可对磷酸化蛋白质特异性染色, 该方法方便、快捷且具有较高的灵敏性, 兼容质谱鉴定, 随后还可再进行其它方法的染色， 目前有很多研究磷酸化的文章都是以这个染料为基础的， 比如Pro-Q WB, (2007,MCP, Identification of Endosomal Epidermal Growth Factor Receptor Signaling Targets by Functional Organelle Proteomics cuturl('http://www.mcponline.org/cgi/reprint/M600463-MCP200v1.pdf'))
  2. DIGE(荧光标记蛋白质差异比较), 这个方法已经成为了比较蛋白质组学的有力武器， 但并不是很适合做磷酸化蛋白的研究，因为磷酸化蛋白质只是某个蛋白质组中的一小部分, DIGE技术不能对其特异性标记， 但是目前也得到了解决， 下面这篇就是其中的一个应用（Proteomics 2006,6,748-756 Detection of phosphorylation patterns in rat corticalneurons by combining phosphatase treatment and DIGE technology)

  
  44274123.snap.jpg

• bgf5 (2014-2-05 23:12:20)

  
  相关疾病：
  头痛
  对磷酸化蛋白的富集也是个大问题
  DIGE技术虽然能鉴定出差异，不过同时做制备胶也是件头疼事

• ukonptp (2014-2-05 23:12:45)

  bgf5战友所提到的两个问题确实都是存在的， 由于磷酸化肽段相对于非磷酸化肽段来说是非常少的, 在质谱鉴定时易被其它肽段掩盖, 所以常常需要对磷酸化蛋白质或肽段富集后再进行鉴定。用于富集磷酸化蛋白质、肽段的方法有IMAC(immobilized metal-affinity chromatography ), 生物素―亲和素富集,免疫沉淀和磷酸化抗体亲和层析等方法。
  DIGE技术最开始是饱和标记， 近几年已经逐渐被MINIMAL DYE（下图为标记原理， 只标记赖氨酸的氨基）所取代， 上样量要求小，所以一般是需要制备胶来进行鉴定。 不过制备胶有时候因为受灵敏度不够或者是染料不同的影响， 找不到目标差异， 所以会对结果鉴定产生影响。

  
  29478157.snap.jpg

• veiwu (2014-2-05 23:13:18)

  
  研究磷酸化蛋白，用来进行活性分析？

• ending (2014-2-05 23:14:52)

  
  Pro Q Diamond是个不错的选择

• leifengta (2014-2-05 23:15:31)

  
  有没有高通量的检测信号通路磷酸化的方法啊！

• gmjghh (2014-2-05 23:16:09)

  
  楼上所说的pro Q磷酸化蛋白的染色，是不是需要把目的蛋白表达纯化出来呢？如果直接提取细胞中的蛋白，那有无数的蛋白具有磷酸化形式啊。好像也很麻烦。。