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【求助】如何大量提取细胞膜蛋白。
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各位师兄师姐：本人想提取大量细胞膜蛋白做受体纯化，已设计把RAW264.7细胞打入小鼠腹腔，收集腹水细胞及腹腔肿瘤，但收集到的细胞如何保存，文献上说要保存到裂解液中，然后提膜蛋白，不知该如何进行。细胞裂解液可以自己配吗。已经买了pierce膜蛋白提取试剂盒，但做蛋白纯化需要大量的蛋白，怎么办啊，请各位师兄师姐帮帮忙啊。
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最新回复
kuaizige (2014-2-05 23:31:00)
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试验目的是什么？是获取膜总蛋白筛选，还是已知目的蛋白纯化出来进行后续试验？
如果是前者，可能确实需要从细胞提总蛋白，pierce的试剂盒肯定是首选的了，细胞量也应该问题不大，腹水收的细胞量还是相当大的
但是如果是后者不如考虑异源表达，可能更方便后续的试验
信息不全，仅供参考，祝好！
lyxsqs (2014-2-05 23:31:25)
楼主想提取膜蛋白， 常规的方法是分级分离和超速离心即可进行膜蛋白的抽提，但是需要的细胞量很大， 所以楼主选用pierce的膜蛋白试剂盒是正确的选择，楼上也说的很明白了。
这里要补充的一点就是如果楼主选的是Mem-PER Mammalian Membrane Protein Extraction Kit这一款的话（我们实验室用过这个）， 千万不要先把收集到的细胞放到自配的裂解液中， 因为那样细胞的全蛋白都裂解了。 纯化试剂盒中会提供相应的裂解液， 因为这个试剂盒是采用的特异性裂解和液体分相（也就是双水相法）， 所获得的膜蛋白基本都是有1-4个跨膜区的整合膜蛋白，外周膜蛋白基本损失掉了。 要做下游试验的话要记得先去除去污剂。
mamamiya (2014-2-05 23:31:59)
谢谢楼上两位的答复。试验目的是获取膜总蛋白筛选，获取膜总蛋白后做亲和层析，所以需要大量的膜蛋白，因为pierce的试剂盒太贵，而本人又是新手，害怕做错了后无法继续下去。所以想多了解一下，细胞量应该是没问题，就是不知道该如何提取膜蛋白。能再提供一点信息吗。
flower@@ (2014-2-05 23:32:36)
ztonyc (2014-2-05 23:32:53)
去污剂的去除一般有相关的kit，或者采用普通的透析等实验。
但获取膜总蛋白后做亲和层析然后纯化蛋白——这个是不是有点难度，毕竟膜蛋白本身丰度就很低，你再进行多次处理，会不会损失太过严重？
cwcwcww (2014-2-05 23:33:54)
除了离心法外，有一个自己DIY的方法，不一定要借助试剂盒
用生物素标记整个细胞表面，然后裂解细胞和膜，然后用亲和素的柱子去抓
大白菜 (2014-2-05 23:34:25)
这里要补充的一点就是如果楼主选的是Mem-PER Mammalian Membrane Protein Extraction Kit这一款的话（我们实验室用过这个）， 千万不要先把收集到的细胞放到自配的裂解液中， 因为那样细胞的全蛋白都裂解了。 纯化试剂盒中会提供相应的裂解液， 因为这个试剂盒是采用的特异性裂解和液体分相（也就是双水相法）， 所获得的膜蛋白基本都是有1-4个跨膜区的整合膜蛋白，外周膜蛋白基本损失掉了。 要做下游试验的话要记得先去除去污剂。
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不知采用分级分离和超速离心提取膜蛋白需要多少细胞？
tudou85 (2014-2-05 23:34:52)
vvmmoy (2014-2-05 23:35:20)
有人私下给我发邮件问生物素这个方法，发现得率不高
回复了一下也帖到这里来吧
这里可能2个环节会出现问题
1，你标记的水平，大约百分之多少的蛋白被标记上了，是否有检测？比如用亲合素标记的FITC（SIGMA有卖）去抚育一下你标记生物素的细胞，然后多清洗几次，洗干净了以后去荧光显微镜观察荧光强度，大概可以知道标记的程度
2，你膜蛋白的释放，你裂解细胞的时候，膜蛋白是否从膜上面都解离下来
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