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标题:【求助】蛋白质混合物中怎么测定目标蛋白的浓度呢?

079777chao[使用道具]
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【求助】蛋白质混合物中怎么测定目标蛋白的浓度呢?


各位大神新年好!我现在读研一,上学期拿到课题,是要在一种混合蛋白体系中测定某一种蛋白的浓度。我现在查到的资料大部分都是说用免疫的方法。请问各位师兄师姐还有没有其他方法呢?小女子在这谢谢各位啦~!
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jingling845[使用道具]
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回复 #1 079777chao 的帖子

可以做个SDS-PAGE把蛋白分开,如果目的条带比较明确的话,直接灰度扫描可以有个相对含量,不会很准确,但是可以参考
要不就是AKATA把蛋白都分开,这个会很准确了,不过很麻烦
还有就是你说的免疫的方法,指的是ELISA吧,先确定总蛋白浓度,然后ELISA确定目的蛋白含量就行,其实还是这个最简便了
供参考!
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079777chao[使用道具]
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我之前也想过SDS-PAGE电泳的方法。不过我导师的意思好像就是直接测,不把蛋白分开。
免疫的方法不止是ELISA吧,好像还有其他什么放射免疫扩散法之类的应该也可以吧?
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jingling845[使用道具]
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ELISA应该是其中最简便的方法了,免疫的方法肯定还有很多,不过其他的没有做过不是很清楚
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langlang[使用道具]
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导师的意思我觉得也不一定是绝对的,实验方法总是可以讨论的。
首先是确定方法的类别和你所需要的蛋白定量精度
除非你的目标蛋白有些特殊的生化性质,比如说是个酶什么的,否则,只能要么分离样品,要么用免疫学的方法。
然后,你是只需要半定量地了解大致浓度还是要比较准确的定量。
就分离样品然后测定而言,SDS-PAGE扫描灰度分析很简单,对设备仪器要求也低,但是只是一种半定量方法,不能精确定量。我没用过斑竹提及的AKATA,不过也许液相色谱的原理应该都差不多,如果你的蛋白体系比较简单,蛋白种类比较少的话,可以考虑用HPLC来测,这个相对比较简单经济,定量也准,但需要一定的设备和预试验。
免疫学方法无论如何就是抗体抗原反应,在一锅粥里面检测某种特定蛋白的含量。elisa在免疫学方法里面算是比较简单和常用的定量方法了,如果实验室钱多的花不完的话可以直接买现成的试剂盒,最省事,不行的话也可以自己包被。放免法其实个人觉得只有比ELISA更麻烦,我个人觉得能不用放射性元素就不要用。
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079777chao[使用道具]
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呵呵!谢谢ls的两位。我这个是要比较准确多定量,我之前也是准备用SDS-PAGE扫描灰度分析,但是老板直接说这种方法已经很成熟了,不想要我用这种方法。我这个课题的目的就是找到目标蛋白特定的、简便的测定方法。
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langlang[使用道具]
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哦,原来你要做方法学啊,那你的样品有什么很特殊的特点呢?
如果你要设计新方法,那你人为旧方法,比如说ELISA,HPLC,有什么劣势缺点呢?
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079777chao[使用道具]
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回复 #7 langlang 的帖子

呵呵,对啊!我要测的蛋白有的有抗菌性,有的有抑制蛋白酶活性。(我要测两三种蛋白)
ELISA一般都能想到,而且现在技术比较成熟了,我觉得实在没其他的方法就用这种方法吧。我想找些新的方法,但是没什么思路。所以想看看大家有没有新想法。至于hplc么,我们院的hplc实在是太抢手了,一个月估计才能轮到一天。
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langlang[使用道具]
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也许你也可以利用你的蛋白的生化性质来检测
比如说固定稀释浓度测测抑菌圈大小之类的,做个标准曲线
或者说有些什么细菌能表达个什么酶,能使某个底物显色啊,发光阿之类,你抑菌了以后就减少了显色发光什么的
不过呢,我觉得这样测出来的也许就不是浓度,而是效价了
我个人觉得,除非你觉得你的方法能更简单,或者解决了什么问题,否则如果纯粹是为了新方法而新方法的话,意义也许不是很大。
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c86v[使用道具]
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你要有更好的技术,可以直接买给公司。不要告诉你导师,呵呵
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