【求助】蛋白质混合物中怎么测定目标蛋白的浓度呢？

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• jingling845 (2014-2-05 23:46:12)

  可以做个SDS-PAGE把蛋白分开，如果目的条带比较明确的话，直接灰度扫描可以有个相对含量，不会很准确，但是可以参考
  要不就是AKATA把蛋白都分开，这个会很准确了，不过很麻烦
  还有就是你说的免疫的方法，指的是ELISA吧，先确定总蛋白浓度，然后ELISA确定目的蛋白含量就行，其实还是这个最简便了
  供参考！

• 079777chao (2014-2-05 23:46:39)

  我之前也想过SDS-PAGE电泳的方法。不过我导师的意思好像就是直接测，不把蛋白分开。
  免疫的方法不止是ELISA吧，好像还有其他什么放射免疫扩散法之类的应该也可以吧？

• jingling845 (2014-2-05 23:47:02)

  
  ELISA应该是其中最简便的方法了，免疫的方法肯定还有很多，不过其他的没有做过不是很清楚

• langlang (2014-2-05 23:47:48)

  
  导师的意思我觉得也不一定是绝对的，实验方法总是可以讨论的。
  首先是确定方法的类别和你所需要的蛋白定量精度
  除非你的目标蛋白有些特殊的生化性质，比如说是个酶什么的，否则，只能要么分离样品，要么用免疫学的方法。
  然后，你是只需要半定量地了解大致浓度还是要比较准确的定量。
  就分离样品然后测定而言，SDS-PAGE扫描灰度分析很简单，对设备仪器要求也低，但是只是一种半定量方法，不能精确定量。我没用过斑竹提及的AKATA，不过也许液相色谱的原理应该都差不多，如果你的蛋白体系比较简单，蛋白种类比较少的话，可以考虑用HPLC来测，这个相对比较简单经济，定量也准，但需要一定的设备和预试验。
  免疫学方法无论如何就是抗体抗原反应，在一锅粥里面检测某种特定蛋白的含量。elisa在免疫学方法里面算是比较简单和常用的定量方法了，如果实验室钱多的花不完的话可以直接买现成的试剂盒，最省事，不行的话也可以自己包被。放免法其实个人觉得只有比ELISA更麻烦，我个人觉得能不用放射性元素就不要用。

• 079777chao (2014-2-05 23:48:05)

  
  呵呵！谢谢ls的两位。我这个是要比较准确多定量，我之前也是准备用SDS-PAGE扫描灰度分析，但是老板直接说这种方法已经很成熟了，不想要我用这种方法。我这个课题的目的就是找到目标蛋白特定的、简便的测定方法。

• langlang (2014-2-05 23:48:28)

  
  哦，原来你要做方法学啊，那你的样品有什么很特殊的特点呢？
  如果你要设计新方法，那你人为旧方法，比如说ELISA，HPLC，有什么劣势缺点呢？

• 079777chao (2014-2-05 23:49:16)

  呵呵，对啊！我要测的蛋白有的有抗菌性，有的有抑制蛋白酶活性。（我要测两三种蛋白）
  ELISA一般都能想到，而且现在技术比较成熟了，我觉得实在没其他的方法就用这种方法吧。我想找些新的方法，但是没什么思路。所以想看看大家有没有新想法。至于hplc么，我们院的hplc实在是太抢手了，一个月估计才能轮到一天。

• langlang (2014-2-05 23:49:38)

  
  也许你也可以利用你的蛋白的生化性质来检测
  比如说固定稀释浓度测测抑菌圈大小之类的，做个标准曲线
  或者说有些什么细菌能表达个什么酶，能使某个底物显色啊，发光阿之类，你抑菌了以后就减少了显色发光什么的
  不过呢，我觉得这样测出来的也许就不是浓度，而是效价了
  我个人觉得，除非你觉得你的方法能更简单，或者解决了什么问题，否则如果纯粹是为了新方法而新方法的话，意义也许不是很大。

• c86v (2014-2-05 23:50:10)

  
  你要有更好的技术，可以直接买给公司。不要告诉你导师，呵呵

• nikun230 (2014-2-05 23:50:42)

  
  要“准确”测定的话，当然是用蛋白含量测定的办法，测纯蛋白了。现在你的是不纯的蛋白，定量只能是用间接的方法，结果也是相对的了。比如测活，这样跟你的蛋白活性就有关系了，失活或部分失活的话都影响定量。有标准对照的话，理论上用HPLC是个选择，但实际也是要比较纯的时候才适用

• 079777chao (2014-2-05 23:51:08)

  HPLC要求样品比较纯，而且我们院的HPLC实在太抢手了！
  有没有做过这方面的大神啊 来帮帮忙吧！