【求助】这样的蛋白表达如何用western检测

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• uuooii (2014-2-07 14:48:10)

  
  你的蛋白本身分子量就特别小，在转膜的过程中很容易转过去。所以要重视这个问题，你可以咨询whatman或者其它公司有关转印膜的技术支持，询问有没有专是针对小分子量蛋白的膜，再尝试下。

• 如影随形 (2014-2-07 14:48:40)

  我现在还有一种顾虑就是，这么小的蛋白在细胞内表达会不会被细胞自身清除，我现在的RT-PCR结果显示瞬时转染目的细胞该蛋白的mRNA的表达水平有非常明显的增加，如果我想得到高表达目的蛋白的细胞同时又不引起蛋白降解应该把收蛋白的时间控制在什么时候为宜？如果真的发生降解，有什么办法可以控制呢？

• one (2014-2-07 14:51:39)

  
  我觉得可以从两个方面考虑：
  1.这几个蛋白是不是别人也用过，查查文献，看看大家都用什么条件，这几个蛋白有什麽特性等。
  2.如果没有任何人做过，那就只能自己摸索了，一般转染后蛋白的表达在24-48小时就比较高了，所以建议你摸几个时间点（12，24，36，48，72等），做个WB，就知道最佳的时间了。
  3.蛋白降解有好几个途径，控制降解我没有经验。但我觉得既然是自然存在的蛋白，就应该能做出来，何况是过表达，没有道理降解得一点不剩。

• 如影随形 (2014-2-07 14:53:31)

  我这三个蛋白目前没有查到任何文献的具体做法。我将目的基因连接在了逆转录病毒载体上，当每次用病毒上清感染靶细胞时发现细胞状态非常差，由于目前无法得出western的结果确定蛋白表达量，只能通过免疫荧光来进行判断，但我的目的是研究蛋白的具体功能，比如对线粒体的影响，那么在24-48小时内线粒体功能的变化（如果严重削弱）很难排除是由于病毒对其产生影响，即便是用空载体感染的对照组细胞状态甚至有时候更差，这个时候组间的差异应该怎么控制呢？

• one (2014-2-07 14:54:10)

  
  我没做过逆转录病毒载体，说一下看法仅供参考，既然病毒可能对其产生影响，为什么一定用病毒载体，效率高？不如换个载体，用质粒怎么样，质粒似乎影响小些。

• 如影随形 (2014-2-07 14:54:27)

  关于western转膜问题：我们这里用的已经是0.22um的PVDF膜了，请问还有更小孔径的吗？

• yjf1026 (2014-2-07 14:55:29)

  
  我有三个蛋白，最小的30个氨基酸，最大的65个氨基酸，做了很多次western都没有看见明显阳性条带。请问有什么办法能证明我的这种目的蛋白的表达？
  首先考虑你蛋白裂解的效果如何，每次内参做了没有，如果蛋白提取不好，我想结果肯定不理想b-actin做下看看，或者跑胶考马斯亮蓝染一下看看
  其次考虑你抗体有效性的问题，有没有文献提供确实表达这三个蛋白（或者有其中一种）的细胞，你裂解一下，作为阳性对照，这样你也可以验证一下你抗体的有效性
  还有转膜的问题分子量跨度有点大30-65，我平常用NC膜，30转半个小时，65转一个小时十五分钟，你这几个不适宜同时做，除非这几个分子表达丰度高，你转膜选择一个折中时间，但对你不合适，我们都是想得到理想结果吗
  最后二抗，ECL等有效性也请验证一下
  我想总结的是wb就是样品一抗二抗ECL是重点考虑的，你可以对照看一下

• 如影随形 (2014-2-07 14:56:04)

  我做过b-actin效果不错，考马斯亮蓝也染过，可以看到不少条带，太不特异没法说事。
  做western的抗体应该不是问题，我们课题组在提取动物组织的wb中用它至少可以出非常明显的条带。但组织中是一种全长的蛋白，也就是说我把这种蛋白切成了三段进行表达，于是就变小了。但是wb的一抗不是只取决于蛋白的一级结构吗？应该分别针对这几段的抗体也是有效的。
  转膜的时候我们实验室倒是转3个小时，下次我按照您的时间试试，我想问的是您也做这么小的蛋白吗？都用wb证实了小分子蛋白的表达亮了是吗？如果是就太好了，我终于看到希望了，做了一个学期都没有得出这个结果。现在正处于放弃的边缘。
  二抗我们课题组用的都是中杉的，效果都不错。

• okhaha (2014-2-07 14:56:29)

  
  分子量很小，你可以用0.22um小孔径的膜；还有你可以用小的Tricine-SDS-PAGE法跑电泳。

• NBA (2014-2-07 14:56:51)

  
  做western的抗体应该不是问题，我们课题组在提取动物组织的wb中用它至少1.可以出非常明显的条带。但组织中是一种全长的蛋白，也就是说我把这种蛋白切成了三段进行表达，于是就变小了。但是wb的一抗不是只取决于蛋白的一级结构吗？应该分别针对这几段的抗体也是有效的。
  这个免疫方面的我不是太在行，但如果你一抗是单抗，那你得研究一下说明书，看看抗体制备的时候用的抗原肽序列，不过可以肯定，你把一个分子cut成三段，用它的一个抗体去检测不太可能全部检测出来。
  2.转膜的时候我们实验室倒是转3个小时，下次我按照您的时间试试，我想问的是您也做这么小的蛋白吗？都用wb证实了小分子蛋白的表达亮了是吗？
  必须说明的是我用的是半干转膜，小分子一般十几分钟。我最小做过10kd的转膜15分钟，可以得到明显特异的条带。
  3.二抗我们课题组用的都是中杉的，效果都不错。
  我们也用过，是不错
  我觉得你目前需要明确的是你把一个分子切成三段，用一个抗体去检测的可行性，可能说的有点乱，不过我想你能领会的。欢迎拍砖交流

• 如影随形 (2014-2-07 14:57:20)

  我的三个蛋白分别买了三个一抗，分别是抗N端、中间端和C端的（我的蛋白就是被切成了这三段），抗体说明书上会有明显的条带，可是都是抗全长蛋白的。
  半干转我不会，我们实验室用的都是湿转，不知道这两者各有什么优势。

• NBA (2014-2-07 14:57:37)

  
  半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统，将膜，胶，滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的，叫湿法；用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法；
  半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的；而湿转的话电流是恒定的，时间也是根据分子量而定。
  你的蛋白分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了。干转的话，用0.725 A/cm2， 10min左右就应该够了。
  我的三个蛋白分别买了三个一抗，分别是抗N端、中间端和C端的（我的蛋白就是被切成了这三段），抗体说明书上会有明显的条带，可是都是抗全长蛋白的。
  如果你的蛋白没有做过修饰，应该也可以用三个抗体分别识别三个片段，只要抗原识别肽一样就行
  另外，你非要做western 吗，如果只是定性检测的化，可否考虑用PCR，分别设计各段特异性引物，是否容易检出，小分子蛋白的western难度还是很大的

• 如影随形 (2014-2-07 15:00:21)

  
  我用过PT-PCR来检测基因表达水平，各片段都表达相当高，可是，在蛋白水平会不会被降解？这除了用western还有其它的方法来检测吗？

• NBA (2014-2-07 15:01:02)

  QUOTE:

  原帖由 如影随形 于 2014-2-7 15:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  我用过PT-PCR来检测基因表达水平，各片段都表达相当高，可是，在蛋白水平会不会被降解？这除了用western还有其它的方法来检测吗？

  不能排除蛋白修饰的可能，再查资料明确一下，如果没有那就优化条件
  

• nvdabing (2014-2-07 15:01:25)

  你的蛋白被切的太小了，容易降解。
  但是过表达一般量也挺高的，降解也不见得会这么彻底。
  归根结底你都不清楚蛋白到底表达没有，所以直接做WB，很难找问题。
  我建议你再构建几个GFP fusion protein，看看荧光信号就知道表达情况怎么样，完了再做WB，这样问题就好找了。